ИММУНОДИАГНОСТИКУМ РАКА ЯИЧНИКОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/54 G01N33/574 

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для иммунодиагностики рака яичников.

Известно, что рак яичников остается одним из самых трудных для диагностики заболеваний: 70-80% больных выявляют в поздних (III-IV) стадиях заболевания и, вследствие поздней диагностики, эти больные погибают в течение 3-х - 5-ти лет. По нашим данным, около 30% больных раком яичников имеют детородный возраст.

Используемый для целей диагностики опухолевый маркер СА-125 (Bast R.C. et all. , J. Clin. Invest., 1981, v.68, 5, p. 1331-1337) при изучении оказался неспецифическим маркером как доброкачественных, так и злокачественных асцитов и весьма мало информативным в ранних (I-II) стадиях рака яичников. Однако более специфичного иммунодиагностикума для рака яичников пока не предложено.

Целью изобретения является создание иммунодиагностикума для рака яичников и отработка технологии его получения.

Цель достигается тем, что из опухолевой ткани рака яичников человека выделяют сывороточный онкоовариальный альфа-1-глобулин (Пат. 2022559, Бюл. "Открытия, изобретения", 1994, 21, c. 21) получают к нему антитела и используют их при формировании диагностической тест-системы.

Способ поясняется на конкретных примерах получения иммунодиагностикума.

Пример 1. К 100 мл ДЭАЭ-сефарозы, уравновешенной трис-НСl буфером (0,1М, рН-8,0), приливают 100 мл экстракта аденокарциномы яичников человека, содержащей 10 мг онкоовариального альфа-1-глобулина, инкубируют при перемешивании 30 мин и фильтруют через воронку Бюхнера в 100 мл интактной ДЭАЭ-сефарозы, уравновешенной тем же буфером. К 200 мл белковой фракции, несвязавшейся с ДЭАЭ-сефарозой, добавляют 62 г кристаллического сульфата аммония, после полного растворения соли инкубируют 30 мин, центрифугированием отделяют осадок, растворяют его в 10 мл дистиллированной воды и хроматографируют на колонке с сефадексом Ж-100. Объединяют белковые фракции с молекулярной массой 25-45 кД, переосаждают белок сульфатом аммония (из расчета 310 г/л), осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и вновь хроматографируют на колонке с сефадексом Ж-150. Фракцию белка с молекулярной массой 33-37 кД лиофилизируют, растворяют в 1 мл трис-глицинового буфера и используют для иммунизации.

Кролику вводят внутрикожно 0,1 мл эмульгированного белкового раствора (100 мл онкоовариального альфа-1-глобулина) с равным объемом полного адъюванта Фройнда 1 раз в неделю в течение 4-х недель. Через месяц подкожно вводят возрастающие дозы белка: 100, 200 и 300 мкг белка через день без адъюванта. На 7-ой день после последней инъекции у кролика берут кровь из ушной краевой вены в объеме 40-50 мл. Реиммунизацию проводят через месяц.

Сыворотку крови отделяют центрифугированием (6000 об/мин (10 мин). С данной иммунной сывороткой (антисыворотка к онкоовариальному альфа-1-глобулину) титрованием антигена моделируют стандартную преципитирующую тест-систему (иммунодиагностикум), в которой соотношение антиген:антитело равно 1:5, проводят контроль специфичности данной тест-системы и аликвоты лиофилизируют.

Пример 2. Выделение онкоовариального альфа-1-глобулина, иммунизацию животных и получение антисывороток проводили, как в Примере 1, но соотношение антиген:антитело в иммунодиагностикуме составляло 1: 7,5.

Пример 3. Выделение онкоовариального альфа-1-глобулина и последующие действия проводили, как в Примере 1, но соотношения антиген:антитело было 1: 9.

Контроль специфичности иммунодиагностикума осуществляли тестированием индивидуальных образцов сыворотки крови с полученным иммунодиагностикумом.

С иммунодиагностикумом было тестировано: 112 индивидуальных образцов сыворотки крови больных раком яичников, 96 больных с доброкачественными опухолями яичников, 56 больных раком матки, 80 больных миомой матки, 320 доноров (200 женщин и 120 мужчин) и 160 беременных женщин.

При соотношении в иммунодиагностикуме антиген:антитело - 1:5 (Пример 1) тест был положительным у 68 больных раком яичников (60,7%), у 10 больных с доброкачественными опухолями яичников (10,4%) и у 8 больных раком тела матки (14,2%). В остальных случаях тест был отрицательным.

Пример 1 (продолжение). Анализ сыворотки может быть проведен с помощью иммунопреципитационного, иммуноферментного или радиоиммунологического метода. Для анализа иммунопреципитационным методом необходимо 65 мкл сыворотки крови.

Для тестирования сыворотки крови иммунопреципитационным методом предметные стекла (24х76 мм) заливают расплавленным 1,5% агаровым гелем (4,5 мл на стекло). В застывшем агаровом геле специальным штампом пробивают лунки, из которых удаляют гель: центральная лунка (d 4мм) для тест-антител, две лунки (d 3 мм) для тест-антигена и 4 лунки (d 6 мм) для тестируемых образцов сыворотки крови. Расстояние между краями лунок составляет 3 мм. В перечисленной последовательности в эти лунки заливают 30 мкл раствора тест-антител, по 20 мкл раствора тест-антигена и по 65 мкл сыворотки крови больных. Агаровые пластинки на стеклах с залитыми образцами инкубируют в чашках Петри в термостате при температуре 37^oС 16-18 ч и читают реакцию. Чувствительность данной тест-системы составляет 1 мкг/мл.

Стандартная преципитирующая тест-система (антиген-антитело) формирует прямую линию преципитации, равно удаленную от краев лунок с тест-антигеном и тест-антителами. Линия преципитации тест-системы упирается в лунку с образцом сыворотки крови, если концентрация в нем СОВА-1 ниже 1 мкг/мл (отрицательная проба), но плавно изгибается (под углом 120^o) у лунки с образцом сыворотки крови, концентрация антигена в котором 1 мкг/мл и выше (положительная проба). Для объективности оценки результатов реакции препараты фотографируют (в рассеянном свете - линия преципитации черная на белом фоне), затем высушивают, окрашивают белковыми красителями (амидо-черный, кумасси голубой) и хранят без доступа света. Интенсивность окраски сохраняется более десяти лет.

При соотношении в иммунодиагностикуме антиген:антитело - 1:7,5 (как в Примере 2) тест на онокоовариальный альфа-1-глобулин был положительным у 84 больных раком яичников (75%: в I-II стадии 70% и в III-IV стадии 76%), у 12 больных доброкачественными опухолями яичников (12,5%) и у 14 больных раком матки (25%). В остальных случаях тест был отрацательным.

При соотношении в иммунодиагностикуме 1:9 (антиген:антитело), как в Примере 3, тест был положительным у 60 больных раком яичников (53,5%), у 8 больных доброкачественными опухолями яичников (8,3%) и у 5-ти больных раком матки (8,9%). В остальных случаях тест был отрицательным.

Следовательно, оптимальные соотношения антиген:антитело в иммунодиагностикуме 1:7,5.

Основные критерии специфичности иммунодиагностикума рака яичников.

1. Результат должен быть отрицательным (чувствительность теста 1 мг/л) при тестировании сыворотки крови здоровых людей не менее 100 образцов и беременных женщин не менее 40 образцов.

2. Положительный результат должен быть в 60-75% случаев при раке яичников и не более 25% при доброкачественных опухолях яичников.

Конкретные примеры применения иммунодиагностикума.

Пример 4. Больная А., 21 год, история болезни 22709, поступила в гинекологическое отделение 1-ой Городской больницы с диагнозом "миома матки" 1.06.98 г.

Тест на онкоовариальный альфа-1-глобулин был положительный.

На операции обнаружена и удалена опухоль яичника.

Гистологический диагноз: пограничная папиллярная пролифилирующая цистоадеиома яичника.

Больная выписана в удовлетворительном состоянии.

Пример 5. Больная С., 17-ти лет, история болезни 5155, поступила в гинекологическое отделение 1-ой Городской больницы 25.02.99 г. с подозрением на внематочную беременность.

Тест на онкоовариальный альфа-1-глобулин был положительным.

На операции обнаружена и удалена опухоль яичника.

Гистологический диагноз: тератобластома плюс муцинозная цистоаденокарцинома яичника.

Больная выписана в удовлетворительном состоянии.

Значение предлагаемого иммунодиагностикума для медицины состоит в том, что он не только позволяет выявлять рак яичников в ранних (I-II) стадиях, но дает позитивную информацию на более ранних этапах эволюции рака яичников - на стадии перерождения клеток доброкачественной опухоли в злокачественные клетки, так называемые "пограничные опухоли яичников" - Пример 4.

Применение предлагаемого имунодиагностикума рака яичников повышает процент выявления заболевания в ранних стадиях, в том числе среди женщин детородного возраста.

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для иммунодиагностики рака яичников. Сущностью изобретения является иммунодиагностикум рака яичников, представляющий собой тест-систему антиген-антитело, в которой антигеном является онкоовариальный альфа-1-глобулин при соотношении к антителам от 1:5 до 1:9. Техническим результатом является создание иммунодиагностикума рака яичников, позволяющего повысить процент выявления заболевания в ранних стадиях.

Иммунодиагностикум рака яичников представляет тест-систему антиген-антитело, в которой антигеном является онкоовариальный альфа-1-глобулин при соотношении к антителам от 1: 5 до 1: 9.