Способ диагностики клещевого энцефалита Советский патент 1988 года по МПК G01N33/49 

со

00 Од

о

СП

00

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологической диагнос- tикe клещевого энцефа,1гата.

Целью изобретения является уско- |)ение и повышение точности способа диагностики клещевого энцефалита.

Способ осуществляют следующим Образом.

Кровь больного забирают из вены в бличестве 3 мл в раствор гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови. Вы- деление лимфоидных клеток производят отстаиванием в течение 45 мин. Клет- ipi 2 раза отмывают средой 199, цент- )ифугируя по 5 мин при 500 q, и дово- их концентрацию ере до и до 10 кл/мл. Для приготовления тест- Ьритроцитарной системы используют Стандартный иммуноглобулиновый зрит- |)оцитарный диагностикум к вирусу кле- iteBoro энцефалита, разработанный IE.Г. Пархоменко и полученный по ори-- И1нальной метопике из свежих бара- ньих эритроцитов. Бараньи эритро- циты формалинизируют нейтраль :Ным формалином при и в 0,5%- :ной концентрации смеиивелот с проти- |воэнцефалитным лошадиным гамма-глобу Чпином производства Томского НИИВС и бидиазотированным бензидином (ком- , |мерческий препарат) .Конт:.югацию -про- :водят 45 мин на ледяной бане. Сенсибилизированные эритроциты отмывают забуференным физиологическим раство- :ром с РН 7,4 и подвергают лиофильно- 1му высущиванию в ампулах, Препарат (может храниться длительное время. Пер.ед постановкой реакции сухой эрит ;роцитарной диагностикум растворяют в физиологическом забуференном раст- .воре с РН 7,4 и обрабатывают в течение 1 ч при +4 С ко1 а 1ерческим антиге нрм вируса клещевого энцефалита. Отбывают 2 раза ЗФР с РН 7,4 путем центрифугирования по 5 мин при 800 q. Из осадка готовят 0,5%-ную взвесь : эритроцитов на этом же растворе.

Пост ановка ре акции. 0,5 мл 0,5% взвеси эритроцитов, при1 отовленных подобным образом, соединяют с равным объемом взвеси лимфоцитов, выделенных от больного. Смесь 1 нкубируют 3-5 мин при 18-25°С, центрифугируют 5 мин при 200 q и выдерживают 20 тлн при . Из осадка готовят мазок, фиксируют и окрашивают по методу Романовского-Гимза. В мазтсе подсчитывают количество лимфоцитов, образую

0

5

0 5 0 5 0

5

0

5

щих розетки с эритроцитами, несущими антиген. За положительный результат принимают величину выще 4% розеткообразующих клеток.

Пример 1. Больной Л. С.И., 40 лет. Заболел 1.7.84 г., госпитализирован в гор. инфекционную больницу 2.7.84 г с подозрением на заболевание клещевым энцефалитом. 2.7.84 г из вены больного забрали 3 мл крови в раствор гепарина. После отстаивания в течение А5 мин при 37°С и отмывания выделено клеток в 1 мл. 0,5 мл взвеси клеток соединяли с 0,5 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитар- ного диагностикума, инкубировали 3 мин при , центрифугировали и выдержали , 20 мин при +4°С, затем из смеси приготовлен мазок и при подсчете обнаружено 8% розеткообразующих клеток - показатель, свидетельствующий о наличии специфической сенсибилизации лимфоидных клеток организма. В официально рекомендованной серологической реакции (РТГА) положительный результат, титр анти- тел 1:80 получен 26.7.84 г - на 26 день болезни в третьей пробе крови. Клинический диагноз заболевания - клещевой энцефалит, менингеальная форма, тяжелое течение.

Пример 2. Больной Е.В., 23 года. Заболел 20.7.84 г, госпитализирован 22.7.84 г. при подозрении на заболевание клещевым энцефалитом. Кровь для исследования взята 22.7.84 г в обьеме 3 мл. После отстаивания и отмывания выделено 2-10 клеток в I мл. 0,5 мл взвеси клеток соединяли с 0,5 мл 0,5%-нЬй взвеси эритроцитар- ного диагностикума, инкубировали i5 NDiH при 25с, центрифугировали и выдерживали 25 мин при +5 с. После этого из смеси готовили мазок и определили 9% розеткообразующих клеток к вирусу клещевого энцефалита. Результат РТГА - отрицательный. Клинический диагноз - очаговая форма клещевого энцефалита, средней тяжести - удалось подтвердить при помощи определения розеткообразования при поступлении больного.

Пример 3. Больная Л. А.Г., 49 лет. Заболела 17.7.84 г. Госпитализирована 21.7.84 г. Кровь в объеме 3 мл взята для исследования 21.7.84 г. После отстаивания и отмывания 0,5 МП взвеси клеток соединя

ли с 0,5 мл 0,5%-ной взвеси эритротщ тарного диагностикума, инкубировали 5 мин при 25 С, центрифугировали и выдерживали 15 мин при +5°С. Из смеси клеток готовили мазок, окрашивали и микроскопировали. Определено 3% розеткообразующих клеток к вирусу клещевого энцефалита, отрицательный результат. Диагностически достове:р- ное нарастание титра антител 1:320 обнаружено во второй пробе крови в РТГА 27.7.84 г. Клинический диагноз заболевания - клещевой энцефалит, ме нннгеальная форма, средней тяжести.

Таким образом, уменьшение време ни холодовой инкубации снижало эффективность розеткообразования. При увеличении времени холодовой инкуба- ции количество розеткообразующих клеток увеличилось до 7% - положи-- тельный результат. Сделан вывод о необходимости инкубации при +4-5 с не менее 20 мин..

Пример 4. Больная Л., 19 лет. Заболела 16.7.84 г. Госпитализировали 19.7.84 г. Кровь в объеме; 3 мл взята для исследования 19.7.84 г Выделение клеток производили путем отстаивания в течение 45 мин и после- дующего отмывания. Затем 0,5 мл взвеси клеток лимфоидного ряда в концентрации 2-.10 в 1 мл соединяли с 0,5 мл 0,5%-ной взвеси, инкубировали

3 мин при 18 С, центрифугировали, вы- 35 ™ повышения точности способа.

держивали 20 мин при . Из смеси клеток готовили мазок, окращивали по методу Романовского-Гимза. В ре зультате подсчета под микроскопом

сенсибилизацию лимфоцитов выявляют в реакции розеткообразования, при этом лимфоциты инкубирук1т с эритро цитарнь м и fмyнoглoбyлинoвым диагно

1396058.

0

0

Положительный эффект способа подтверждается следующими данными: при помощи официально принятых серологических тестов, в частности РТГА и метода антигенспехдафического розеткообразования, обследовано 159 больных клещевым энцефалитом. Диагноз поставлен по клинико-эпидемиологическим данным. Диагностически значимое нарастание титра антител в РТГА выявлено только в 29,93% случаев. Положительные результаты при определении специфического розеткообразования заре5 гистрйрованы у 64,96% больных, что

позволило выявить специфическую сенсибилизацию к вирусу клещевого энцефалита дополнительно у 35,03% больных. Кроме того, при использовании

реакции антигенспецифического розеткообразования лабораторное подтверждение диагноза клещевого энцефалита ускоряется на 10-14 дней по сравнению с использованием традиционных

5 серологических тестов (РТГА) и на 2 сут. по сравнению с реакцией торможения миграции лимфоидных клеток по технике исполнения. Ф о рмула изо б р е т е н и я Способ диагностики клещевого энцефалита путем выявления сенсибилизации лимфоцитов к антигену вируса клещевого энцефалита, отличающийся тем, что, с целью ускоресенсибилизацию лимфоцитов выявляют в реакции розеткообразования, при этом лимфоциты инкубирук1т с эритро- цитарнь м и fмyнoглoбyлинoвым диагнос

Изобретение относится к меди цине, точнее к иммунологической диагностике клещевого энцефалита. Цель изобретения - ускорение и повышение точности способа диагностики клещевого энцефалита. Для этого из пробы крови обследуемого вьщеляют лимфоид- ные клетки и доводят их концентрацию до 2,10 КЛ/Ш1. Готовят тест-эритроцит арную систему. Ставят реакцию розеткообразования, выявляя сенсибилизацию лимфоцитов к антигену вируса клещевого энцефалита. Лимфоциты инкубируют с эритроцитарным иммуноглобу- линовым диагностикумом, обработанным антигеном вируса клещевого энцефалита 3-5 мин при 8-25 с и 20 мин при 4-5°С, При наличии розеткообраэующих клеток более 4% диагностируют клещевой энцефалит.При использовании реакции антигенспецифического розеткообразования подтверждение диагноза ускоряется на 10-14 дней. (Л

определено 4% розеткообразующих кле- 40тикумом, обра;ботанным антигеном виру- ток к вирусу клещевого энцефалита.са клещевого энцефалита в течение Результаты РТГА отрицательные. Пер- 3-5 мин при +18-25°С и не менее вичный диагноз клещевого энцефалита20 мин при , и при наличии ро- снят. Окончательный диагноз - респира-зеткообразующих клеток более 4% торно-синцитиальная инфекция. -45диагносцируют клещевой энцефалит.