СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАНАФИЛАКТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1995 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения нового противоаллергического средства из чешуи репчатого лука.

Известен способ получения противоаллергического препарата, приготовленного из репчатого лука (Allium cepa L.) который представляет собой экстракт лукового сока на 45%-ном растворе этилового спирта [1]. Установлено, что предварительное назначение экстракта снижает выраженность кожных аллергических реакций у человека, а при ингаляции - тяжесть анафилактического бронхоспазма у животных [2,3].

Известно также, что противоаллергическими свойствами обладают ряд флавоноидов, в том числе кверцетин и его гликозиды [4,5,6]. В чешуе лука содержатся кверцетин, кверцетин-4' -0- β-D-глюкопиранозид (спиреозид), кверцетин-3,7-диглюкозид и кверцетин-3,4' -диглюкозид. В чешуе некоторых сортов лука найден кемферол.

Известен способ получения кверцетина из чешуи лука путем промывания чешуи водой, затем экстракции метанолом [7]. В этом случае из метанольного извлечения получают смесь кверцетина и церилового эфира церотиновой кислоты. Этот продукт пригоден для лечения заболеваний кишечного тракта и атеросклероза.

Известен способ получения кверцетина из луковой чешуи экстракцией 1%-ным раствором карбоната натрия, содержащего 0,2% сульфита натрия, нейтрализацией полученного экстракта соляной кислотой и промывкой осадка бензолом, хлороформом и эфиром. Однако выход кверцетина по этому способу составляет только 1,5-2%, а для его осуществления требуются значительные количества органических растворителей [8].

Известен способ получения кверцетина путем форэкстракции чешуи сначала хлороформом, затем ацетоном, через некоторое время полученного ацетонового извлечения, сгущением, разбавлением водой и отфильтровыванием осадка. Выход составляет 2,8% [9].

За прототип взят способ получения противоаллергического препарата из сока луковиц лука репчатого. В этом случае получается сложный комплекс биологически активных соединений с незначительным содержанием флавоноидов.

Целью данного изобретения является разработка способа получения фитосредства, содержащего сумму флавоноидных соединений, из чешуи луковиц лука репчатого, являющегося отходом пищевой промышленности, проявляющего выраженное антиаллергическое действие.

Цель достигается тем, что получение препарата, представляющего собой смесь кверцетина и его гликозидов, осуществляется 3-кратной экстракцией (по 30-40 мин) пропаренной чешуи луковиц лука репчатого (Allium Cepa L.)65-75% -ным этиловым спиртом, отделением экстракта от чешуи и охлаждением в течение 3-4 дней при температуре +2 - +5^оС. Выпавший осадок флавоноидов подвергают очистке однократной перекристаллизацией из 40%-ного этанола. Полученную сумму флавоноидов пропускают через колонку с полиамидным сорбентом, промывают сперва водой, затем 40%-ным и 70%-ным этанолом. Элюаты, содержащие флавоноиды, сгущают до 1/4 первоначального объема и выпавший осадок еще раз перекристаллизовывают из 40%-ного этанола.

Примеры конкретного выполнения.

П р и м е р 1. 100 г измельченной чешуи лука обрабатывают при перемешивании водяным паром для удаления воскового налета (для этого требуется от 30 до 40 мин в зависимости от толщины воскового слоя у различных сортов лука). Сконденсированную воду сливают, а чешую тотчас же заливают 70%-ным этанолом (1,8 л), и проводят экстракцию при температуре кипения этанола в течение 30-40 мин. Полученное извлечение сливают, а сырье вновь заливают свежей порцией экстрагента и кипятят 30-40 мин. После 4-кратной экстракции спирт отгоняют до помутнения раствора и охлаждают в холодильнике при +2 - +5^оС в течение 3-4 дней. Выпавший осадок отделяют и сгущают при температуре 80^оС. Выход 5,92%. Содержание флавоноидов в осадке 78-82%.

П р и м е р 2. По той же методике экстракцию проводят 65%-ным этанолом. Выход осадка 5,80%. Содержание флавоноидов в осадке 70-71%.

П р и м е р 3. По той же методике экстракцию проводят 40-50%-ным этанолом. Выход осадка 4,92%. Содержание флавоноидов в осадке 68-72%. Очистка осадка-сырца. Полученный осадок - порошок желто-коричневого цвета, содержащий 4 флавоноидных соединения, лейкоантоцианидин, продукты конденсации и окисления протокатеховой кислоты и фенолов, подвергают перекристаллизации из 40% -ного этанола, выпавший при охлаждении осадок, освобожденный от продуктов конденсации окисления, растворяют в 90%-ном этаноле и переносят на колонку с полиамидным адсорбентом. Колонку промывают сначала водой, затем желтые зоны флавоноидов элюируют 40%-ным и 70%-ным этанолом. Элюаты сгущают до 1/4 объема и выпавший осадок флавоноидов перекристаллизовывают из 40%-ного этанола. Выпавший через 48 ч осадок флавоноидов содержит от 75 до 85% кверцетина, 5-6% спириозида, около 2% кверцетин-7,4' -диглюкозида и кверцетин-3,4-диглюкозида. В качестве примеси может быть еще один флавоноид - кемферол, который присутствует в незначительных количествах не во всех сортах лука и не оказывает существенного влияния на проявление антиаллергических свойств препарата.

Влияние концентрации спирта на выход суммы флавоноидов видно из табл.1.

Условия кристаллизации изучали методом математического планирования эксперимента. Установлено, что на выход флавоноидов влияет концентрация спирта и время кристаллизации, существенно не влияет температурный фактор.

Кристаллизация из 80%-ного этанола ведет к осаждению различных примесей с низким выходом кверцетина. Кристаллизация из 40%-ного этанола дает осадок, в котором преобладают флавоноиды (см. табл.2).

Изучение противоаллергической активности предлагаемого средства проводили на модели реакции пассивной кожной анафилаксии (РПКА) у крыс, опосредованной IgE-антителами [10] . Данная экспериментальная модель наиболее часто используется для поиска и выявления соединений с антиаллергическими свойствами, так как объективно отражает последовательную цепь патологических изменений, происходящих в организме при реакциях гиперчувствительности немедленного типа [11,12].

Сыворотку, содержащую специфические гомоцитотропные антитела, получали на третьей неделе после сенсибилизации мышей линии СВА овальбумином (0,5 мкг) с гидроксидом алюминия (2,5 мг/мышь) [13]. Полученную сыворотку в разделении 1:200 вводили внутрикожно в количестве 50 мкл в 6 выстриженных участков кожи спины белых крыс-самцов линии Wistar (160-180 г). Через 24 ч крысам внутривенно вводили разрешающую дозу овальбумина (1 мг/кг) в 1 мл 0,5% -ного раствора красителя синего Эванса на физиологическом растворе. Спустя 30 мин крыс под эфирным наркозом декапитировали, кожу выворачивали, прокрашенные участки вырезали и экстрагировали краситель формамидом при 37^оС в течение 4 сут. Количество красителя в экстравазате определяли спектрофотометрически при 600 нм по калибровочному графику [14].

Средство, получаемое по предлагаемому способу, вводили крысам в дозе 100 мг/кг в виде суспензии (по 1 мл), приготовленной на дистиллированной воде с добавлением 1 капли твина-80, специальным зондом в желудок. Контрольным крысам тем же способом вводили растворитель (дистиллированную воду) с 1 каплей твина-80.

Процент ингибирования реакции вычисляли по формуле
А = 100 - , где А - процент ингибирования РПКА;
С - количество (в мкг) красителя синего Эванса в участках кожи крыс, получавших предлагаемое средство;
В - количество (в мкг) красителя синего Эванса в участках кожи контрольных крыс.

Результаты экспериментов обработаны статистически (15) и представлены в табл. 3, в которой показано влияние средства на проявление РПКА у крыс, опосредованной IgЕ-антителами.

Определение острой токсичности и расчеты L^D₅₀ осуществляли по методу Кербера [16]. Белым мышам массой 18-20 г в желудок с помощью зонда вводили по 0,5 мл суспензии средства, приготовленной с 1 каплей твина-80. На каждую дозу в опыте брали по 6 мышей. В результате установлено, что DL₅₀ равна более 1500 мг/кг. Согласно классификации токсичности [17] предлагаемое средство относится к практически нетоксичным.

Предлагаемый способ получения фитосредства из чешуи луковиц репчатого лука отличается от прототипа более высоким содержанием флавоноидных соединений в конечном продукте, а также экономичностью, так как используется не лук, а его отходы - чешуя, и более выраженными антиаллергическими свойствами, обладает активностью на уровне современных противоаллергических препаратов (см. табл.4).

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения фитосредства, обладающего антианафилактическим действием. Сущность изобретения заключается в обработке чешуи лука репчатого водяным паром, экстракции обработанной чешуи водным этанолом, отделении осадка, его высушивании и перекристаллизации из 40% -ного этанола. Технический результат предложения заключается в усилении специфической активности до уровня современных противоаллергических препаратов. 4 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАНАФИЛАКТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, путем экстракции лука репчатого (Allium cepa L.) водным этанолом, отличающийся тем, что используют чешую, перед экстракцией проводят обработку сырья водяным паром, экстракт упаривают, отделяют осадок, сушат и перекристаллизовывают из 40%-ного этанола.