Штамм гибридных культивируемых клеток животных -MUS мUSсULUS -продуцент моноклональных антител к возбудителю амиотрофического лейкоспонгиоза Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть зовано при приготовлении диагностических препаратов.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/C с массой 18- 20 г иммунизируют белком ргр с мол. м. 27-32 кДа, полученным путем последовательной обработки мозговой суспензии нуклеазами, протеазайи, де- ергентами в сочетании с градиентным центрифугированием, по схеме:4- кратно через каждые 7 дней вводят внутрибрюшинно по 0,1 мл белка ргр с полным адъювантом Фрейнда. Концентрация белка ргр составляет 1,0 мг/мл. Через 7 дней после последней иммунизации вводят в селезенку бустерную дозу белка в объеме 0,1 мл.

На 3-й день, после бустерной дозы белка у мышей извлекают селезенки и готовят суспензию активированных лимфоцитов, используемую для слияния с перевариваемыми миеломными клетками X63-Ag 8/653 в соотношении 4:1. Слияние клеток проводят с использованием 50%-ного раствора полиэтилен- гликоля 4000. Гибридные клетки культивируют на селективной среде ГАТ (гипоксаитин - аминоптерин - тими- дин). Из 125 клонов, образовавшихся при слиянии с родителем X63-Ag 8/653, обнаружено 9 гибридных клонов, дающих специфическое связывание с белком ргр в реакции иммунофермент- ного анализа. Путем серийных пассажей клетки наиболее продуктивного клона АЛМА-7 вьшедеиы в массовую

СЛ N5 Ю СП J

культуру. При прививке линейньм мышам BALB/C клеток АЛМА-7 в дозе 6- -12-10 индуцируют образование асцит- ных опухолей.

Полученный штамм АЛМА-7 депонирован под номером ВСКК(П) № 223Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с ядрами, занимающими большую часть клетки. Ядрышки крупные, встречаются двуядерные клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка, или ядро смещено к одной стороне клетки.

Культуральные признаки.

Среда для культивирования - среда Дульбекко с 15% эмбриональной телячьей сьшорютки, пируватом натрия, 4 r/ji глюкозы, 2 1 глютамина, 50 мкг/мл антибиотика гентамицина. Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - через 2-3 сут. Посевная доза 150000 клеток в 1 мл. Кратность рассева (1:3)-(1:5). Стабильная продукция антител на протяжении 29 пассажей.

Культивирование in vivo.

При прививке линейным мышам BALB/c клетки АЛМА-7 в дозе 6-12-10 индуцируют образование асцитных опухолей в среднем через 18 дней. Мьшей предварительно (не менее чем за 5-7 сут до введения клеток) обрабатывают пристаном в дозе 0,4-0,5 мл на мьш1ь для улучшения асцитообразования. От одной мыпи в среднем получают 3,0 мл асцитической жидкости. Асцитическую жидкость осветляют путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. igG осаждают сульфатом ам- ьюния (30% насыщения) и чистят путем аффинной хроматографии. Штамм АЛМА-7 на мылах не перевивается.

Характеристика продукта.

Класс продуцируемых иммуноглобулинов - igG2a. Продуцируемые антитела охарактеризованы в точечном имму- ноферментном методе (ТИФМ).

Изоферменты.

В Культуральные матрасы объемом 250-500 мл засевают гибридные клетки АЛМА-7 в концентрации 150000- 200000 клеток/мл в среде Дульбекко с пируватом натрия, 15% эмбриональной телячьей сьгеоротки, 4 г/л глюкозы, 2 мМ глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. Культуры инкубируют пр в стационарном состоянии.3-4 сут. JQ Клетки отделяют центрифугированием. Надосадок хранят при минус 20°С и используют как образцы КЖ. Осадок кле ток ресуспендируют в 1 мл среды без сыворотки и вводят в полость син- генных мъппей. Через 12-15 сут образуется асцитная опухоль, которую ис зуют как образец .

Пример 2. Определение спе цифической активности моноклонапьны антител ТИФМ.

На нитроцеллюлозные фильтры нано сят по 20 мкл очищенного белка 27- 32 кД АЛ, высушивают и отмьтают 1 р раствором, содержащим 20% изопропип дс вого спирта и 7% уксусной кислоты, 3 раза дистиллированной водой. Зате на ч наносят буфер - 0,05 М трис- НС1, рН 7,4 (буфер О, содержащий 0,5% желатина. После контакта на фильтры наносят исследуемые образцы и помещают в термостат при 37 С на 1 ч. Отмьгеают 5 раз в буфере 1, содержащем 0,05% тритона Х-100 (буфер 2) и 1 раз буфером 1. Наносят ан- тимьш1иный иммуноглобулин, меченый

35

40

50

Подвижность глюкоза-6-фосфатдегид-55 пероксидазой на 1,5 ч и помещают в

10

15

20

- 25

5272574

Контаминация.

Бактерии не.обнаружены, грибы и дрожжи не обнаружены, микоплазмы не обнаружены, вирусы - обнаружены частицы типа А и С, аналогичные частицам родительского штамма клеток X63-Ag 8/653.

Консервация клеток.

Клетки АЛМА-7 заморожены на if 24 и 26 пассажах. Общее число ампул 40 по 5-7 млн клеток в ампупле. Кри- озащитная среда - ростовая среда с 50-60% эмбриональной телячьей сьто- ротки и 10% глицерина. Выживаемость при размораживании 74%.

П р и М е р 1. Культивирование гибридных клеток и накопление моно- клональных антител в культуральных (КЖ) и асцитических жидкостях (АЖ).

В Культуральные матрасы объемом 250-500 мл засевают гибридные клетки АЛМА-7 в концентрации 150000- 200000 клеток/мл в среде Дульбекко с пируватом натрия, 15% эмбриональной телячьей сьгеоротки, 4 г/л глюкозы, 2 мМ глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. Культуры инкубируют при в стационарном состоянии.3-4 сут. JQ Клетки отделяют центрифугированием. Надосадок хранят при минус 20°С и используют как образцы КЖ. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл среды без сыворотки и вводят в полость син- генных мъппей. Через 12-15 сут образуется асцитная опухоль, которую используют как образец .

Пример 2. Определение специфической активности моноклонапьных антител ТИФМ.

На нитроцеллюлозные фильтры наносят по 20 мкл очищенного белка 27- 32 кД АЛ, высушивают и отмьтают 1 раз раствором, содержащим 20% изопропипо- дс вого спирта и 7% уксусной кислоты, и 3 раза дистиллированной водой. Затем на ч наносят буфер - 0,05 М трис- НС1, рН 7,4 (буфер О, содержащий 0,5% желатина. После контакта на фильтры наносят исследуемые образцы и помещают в термостат при 37 С на 1 ч. Отмьгеают 5 раз в буфере 1, содержащем 0,05% тритона Х-100 (буфер 2) и 1 раз буфером 1. Наносят ан- тимьш1иный иммуноглобулин, меченый

35

40

50

-55 пероксидазой на 1,5 ч и помещают в

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при приготовлении диагностических препаратов. Штамм АЛМА-7 депонирован под номером ВСКК(П) N 223Д. Получают штамм путем иммунизации мышей линии BALB/C белком PRP с мол.м 27-32 кДа по схеме. Активированные лимфоциты сливают с миеломными клетками X63-AG8/653 в соотношении 4:1 с использованием ПЭГ 4000. Гибридома продуцирует моноклональные антителя JGG 2а класса. Стабильная продукция антител на протяжении 29 пассажей. Штамм на мышах не перевивается. 1 табл.

рогеназы и лактатдегидрогеназы в клетках клона АПМА-7 характерна для мьши- ных клеток.

термостат при 37 С. Отмывают 6 раз буфером 2, 1 раз буфером 1 и 1 раз дистиллированной водой. Погружают в

раствор 3 4-диаминобензидина с 0,005% на 5 мин и отмьгоают водой 5-6 раз.

Реакцию считают положительной, если на фильтре образуется коричневое пятно.

Результаты проведенных исследований приведены в таблице.

Результаты, полученные , свидетельствуют, что моноклоиальные антитела специфически реагируют только с белком ргр 27-32 кД АЛСП и не реагируют с белком с такой же молекулярной массой, полученным из нормальной ткани ЦНС.

Полученный штамм гибридных клеток АЛМА-7 синтезирует высокоспецифические моноклональные антитела к белку ргр - возбудителю амиотрофического лейкоспонгиоза класса IgG, подкласса 2а, с титром в ТИФМ 1:10000 (АЖ).

27257

Таким образом, моноклональные антитела могут служить сырьем для получения диагностических препаратов.

Моноклональные антитела незаменимы для получения методом аффинной хроматографии высокоочищенных белков для изучения взаимосвязей между раз10 личными представителями группы прио- нов. Они могут оказаться полезными для изучения патогенеза заболевания и разработки новых методов прижизнен - ной диагностики.

15

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П} 20 № 223Д - продуцент моноклональных антител к возбудителю амиотрофического лейкоспонгиоза.