ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОГЕРПЕСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1995 года по МПК C07D239/54 A61K31/505 

Изобретение относится к новому антигерпесному средству, которое может найти применение в медицине.

Известны противовирусные производные пиримидинового ряда, например 5-Е-(2-бромвинил)-2^l-дезоксиуридин, который обладает высокой противогерпесной активностью, однако, являясь хорошим субстратом для клеточной уридинфосфорилазы, он быстро активируется с расщеплением по гликозидной связи, что вызывает необходимость поддержания его постоянной концентрации для обеспечения терапевтического действия.

Наиболее эффективным противовирусным соединением, применяемым в настоящее время для лечения заболеваний, вызываемых вирусом герпеса, является-9[(2-гидроксиэтокси)метил-гуанин(ацикловир)] Однако это соединение проявляет мутагенные свойства, кроме того, выделены резистентные по отношению к ацикловиру штаммы вирусов герпеса.

Цель изобретения поиск в ряду производных пиримидина, которые могут найти применение как соединения, обладающие противогерпесной активностью при низкой токсичности.

Поставленная цель достигается применением 1-аллил-оксиметилурацила формулы

в качестве вещества, обладающего противогерпесныим действием. Ранее это соединение было предложено в качестве полупродукта для синтеза соединений, обладающих противовирусной и противоопухолевой активностью. Применение его в качестве соединения, обладающего антигерпесной активностью, не известно.

П р и м е р 1. 1-Аллилоксиметилурацил. К суспензии 4,0 г (0,036 моль) урацила в 40 мл тетрахлорметана прибавляют при комнатной температуре 14,6 г (0,090 моль) гексаметилдисилазана и 0,2 г (0,018 моль) триметилхлорсилана и смесь кипятят до образования прозрачного раствора. Растворитель отгоняют и летучие продукты удаляют в вакууме с защитой от влаги воздуха при остаточном давлении 2-4 мм рт.ст. и температуре не выше 100^оС. Получают 9,1 г (99,5%) 2,4-ди(триметилсилилокси)пиримидина в виде прозрачного бесцветного масла. Силилпроизводное растворяют в 20 мл безводного хлороформа и при комнатной температуре добавляют в течение 5 мин раствор 4,7 г (0,044 моль) хлорметилаллилового эфира в 8 мл хлороформа. Реакционную массу перемешивают 24 ч при комнатной температуре, после чего добавляют 100 мл воды и экстрагируют 8 раз по 50 мл хлороформа. Экстракт сушат сульфатом магния, фильтруют и упаривают. Остаток перекристаллизовывают из изопропанола и получают 5,47 г 1-аллилоксиметилурацила, т.пл. 113-116^оС, выход 84,1%
Найдено, C 52,46 H 5,30 N 15,28.

C₈H₁₁N₂O₃.

Вычислено, C 52,74 H 5,53 N 15,38.

R_f=0,61 (этилацетат).

ПМР-спектр, δ, м.д. 4,12 д (6 Гц, 2 Н, -О-CH₂-C=); 5,15-5,50 м (2Н, -С= СН₂); 5,22 с (2Н, N- CH₂-O); 5,73-6,15 м (1Н, -СН=С); 5,85 д (8 Гц, 1 Н Н⁵); 7,43 д (8 Гц, 1 Н Н⁶); 10,02 с (1Н, NH).

Спектр ПМР регистрировали на спектрометре "Tesla BS-567 A" (100 МГц) в режиме FT, 15%-ный раствор в дейтерохлороформе, внутренний стандарт гексаметилдисилоксан, температура образца 20-25^оС.

Проведены биологические испытания 1-аллил-6-метилурацила.

П р и м е р 2. Токсические свойства для тканевой культуры первичных фибробластов эмбрионов кур определяют при введении 1-аллилоксиметилурацила в состав поддерживающей среды (среда 199) в различных концентрациях. После 96 ч инкубации в термостате регистрируют цитопатическое действие при малом увеличении (х80) микроскопа. Затем в поддерживающую среду добавляют 0,1 мл 0,1% -ного раствора нейтрального красного на 1 ч, жидкость удаляют, клетки отмывают от избытка красителя трижды изотоническим раствором хлорида натрия и заливают на 1 ч этанолом. Поглощение нейтрального красного клетками определяют по оптической плотности при длине волны 510 нм. Максимальной переносимой концентрацией (МПК) считают наивысшую дозу 1-аллилоксиметилурацила, не вызывающую изменений морфологии клеток и поглощения ими красителя.

В соответствии с выполненными экспериментами МПК 1-аллилоксиметилурацила составляет не менее 800 мкг/мл. Более высокие концентрации не исследованы.

Токсические свойства для белых мышей массой 7-10 г определяют при однократном внутрижелудочном введении суспензий 1-аллилоксиметиллурацила на 0,5% -ном крахмальном геле. Для каждой дозы вещества используют 4 животных. Наблюдение за животными ведут в течение 10 дней.

Максимальная из исследованных доз, 1000 мг/кг 1-аллилоксиметилурацила, не вызывает гибели ни одной из мышей. Не отмечается также изменение поведения животных.

П р и м е р 3. Антивирусные свойства для тканевой культуры определяют методом редукции бляшек под агаровым покрытием. Монослойные культуры первичных фибробластов эмбрионов кур отмывают от ростовой среды свежей средой 199, наносят разведение вируса герпеса простого 1 типа (штамм 1 С) из расчета 0,00002 БОЕ/клетка на 1 ч, после удаления вируссодержащей жидкости инфицированные клетки покрывают питательной средой на основе концентрата среды 199 с добавлением 1%-ного бактагара; 0,005%-ного нейтрального красного и различных концентраций 1-аллилоксиметилурацила. В контрольные пробы исследуемый препарат не добавляют. Спустя 48 ч инкубации в термостате сосчитывают количество бляшек, образованных под влиянием размножения вируса, на его основе определяют титр вируса. Признаком антивирусного действия считают снижение титра вируса в пробах в присутствии 1-аллилоксиметилурацила по сравнению с необработанным контролем. Минимальную концентрацию, снижающую титр вируса на величину 1,25 lg БОЕ/мл, обозначают как МАК (минимальная активная концентрация) Химиотерапевтический индекс (ХТИ) рассчитывают как отношение МПК и МАК.

Получаемые результаты сводят в табл.1.

В результате проведенных исследований установлено, что изученное соединение проявляет выраженный ингибирующий эффект в отношении вируса герпеса в культуре ткани (см. табл.1). Во всех изученных концентрациях отмечено практически полное подавление инфекционного титра вируса на 1,54 lg БОЕ/мл ХТИ составил 8 и более.

П р и м е р 4. Белых мышей массой 7-10 г инфицируют 1-100 ЛД₅₀ вируса герпеса простого 1 типа (штамм "Коптев") внутрибрюшинно. 1-аллилоксиметилурацил вводят инфицированным мышам внутрижелудочно в виде суспензии на 0,5% -ном крахмальном геле в объеме 0,1 мл 2 раза в сутки в течение 7 дней, начиная спустя 3 ч после инфицирования в дозах 200-1 мг/кг. Контрольным животным вводят крахмальный гель. Наблюдение за мышами ведут в течение 2 недель. Эффективность 1-аллилоксиметилурацила оценивают по снижению летальности в группах в сравнении с контролем. Индекс защиты (ИЗ) рассчитывают по формуле
ИЗ=(А/B-1):А/В.100%
где А процент гибели животных в контроле;
В процент гибели животных в опыте.

Полученные результаты сводят в табл.2.

Из табл.2 видно, что 1-(аллилоксиметил)урацил также эффективно подавляет размножение штамма вируса герпеса, устойчивого к действию ацикловира. Так в концентрациях 400, 200, 100 мкг/мл отмечено снижение титра вируса на 2,42; 1,42; 1,0 lg БОЕ/мл, соответственно. Кроме того, 1-(аллилоксиметил)урацил обладает высоким противовирусным эффектом в отношении экспериментального герпетического менингоэнцефалифта мышей с индексом защиты 47,36-79,59% (см. табл.3).

Таким образом, 1-(аллилоксиметил)урацил, обладая высоким ингибирующим эффектом в отношении вируса герпеса и его штамма, устойчивого к действию ацикловира, проявляет выраженное защитное действие при экспериментальном менингоэнцефалите мышей, а также имеет достаточно низкую токсичность для культуры ткани. МПК составляет 800 мкг/кл, а также ЛД₅₀ на животных составляет свыше 1000 мг/кг. Кроме того, оно активно в отношении штамма вируса герпеса, устойчивого к действию ацикловира (ВПГ^АЦВ).

Использование: в медицине в качестве средства устойчивого к действию ацикловира. Сущность изобретения: использование - 1-аллилоусиметилурацила в качестве вещества, обладающего противогерпесным действием. Соединение получено конденсацией 2, 4-ди(триметилсилилокси)-пиримидина, приготовленного из урацила, с хлорметилаллиловым эфиром в хлороформе. Выход 84,1%, C₈H₁₁N₂O₃ т. пл. 113 - 116°С, МПК 800 мкг/мг, ЛД₅₀ на животных> 1000мг/кг. 3 табл.

Применение 1-аллилоксиметилурацила формулы

в качестве вещества, обладающего противогерпесным действием.