СПОСОБ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к методам экспрессной индикации бактериальных антигенов. Оно может быть использовано при возникновении очага бактериального заражения, а также в случаях, когда требуется получение результатов в кратчайшие сроки.

Известны способы индикации бактериальных антигенов с помощью люминесцентно-серологического метода, который включает приготовление мазков из проб объектов, их последующее высушивание, фиксирование в спирте, обработку в течение 20 мин специфическими люминесцирующими сыворотками с последующим последовательным промыванием растворами фосфатно-солевого буфера в течение 10 мин, просушиванием предметных стекол и просмотром мазков под люминесцентным микроскопом [1]
Этот способ трудоемок при просмотре большого числа препаратов, в процессе исследования используют высокоспецифические люминесцирующие сыворотки, требуются значительные затраты времени от начала исследования до получения результатов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ постановки реакции пассивной гемагглютинации при индикации бактериальных антигенов, который включает внесение эритроцитарного диагностикума в раститрованный исследуемый материал и наблюдение за формированием комплексов бактериальных антигенов с эритроцитарными диагностикумами на днищах емкостей в виде типичной картины окончания реакции [2]
Недостатком этого способа является длительность седиментационного формирования типичной картины оседания эритроцитов на поверхности днищ лунок, так как по размерам и форме очертаний осевших на днище лунок эритроцитов производят учет результатов реакций, а время седиментационного оседания эритроцитов составляет 2-4 ч и не отвечает требованиям ускоренной диагностики микроорганизмов.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что способ индикации бактериальных антигенов включает постановку реакции пассивной гемагглютинации, смешивание исследуемого антигена с эритроцитарным диагностикумом в реакционной среде и учет результатов реакции.

В качестве реакционной среды используют электролит, смесь эритроцитарного диагностикума и исследуемого антигена помещают в микрокамеру, изолируют от электролита агарозой, микрокамеру располагают в электролите изолирующими проводниками перпендикулярно направленности электрического поля, реакцию проводят при напряженности электрического поля 700-1000 В/м и плотности тока 0,1-0,2 А/мм², а учет результатов ведут под малым увеличением микроскопа.

Отличительные признаки изобретения заключаются в том, что в качестве реакционной среды используют электролит, смесь эритроцитарного диагностикума и исследуемого антигена помещают в микрокамеру, изолируют от электролита агарозой, микрокамеру располагают в электролите изолирующими проводниками перпендикулярно направленности электрического поля, реакцию проводят при напряженности электрического поля 700-1000 В/м и плотности тока 0,1-0,2 А/мм^2, а учет результатов ведут под малым увеличением микроскопа.

Способ осуществляется следующим образом.

В лунки полистироловой пластины или в пробирки вносят разводящую жидкость трис-ацетатный буферный раствор рН 8,0 в необходимом объеме 0,2 или 0,4 мл, титруют исследуемый материал с кратностью 2, затем в каждую лунку или пробирку вносят требуемое в соответствии с методом постановки (микро- или макрометодами) количество эритроцитарного диагностикума, который в зависимости от характера исследуемого материала может быть иммуноглобулиновым или антигенным. Микрокамеры, т.е. капиллярные трубки, используемые для осуществления способа, заполняют содержимым из каждой лунки или пробирки после их легкого встряхивания. В качестве микрокамер можно использовать капилляры из комплекта "Сыворотка диагностическая к С-реактивному белку", выпускаемая предприятием по производству бактериальных препаратов "АНТИГЕН" в г. Электрогорске. Заполненные исследуемым материалом микрокамеры располагают на столике в небольшой горизонтальной электрофоретической камере, размеры которой позволяют помещать ее на предметном столике микроскопа. Торцевые отверстия микрокамер ориентируют в направлении к электродам. Обращенные в направлении к электродам торцевые отверстия микрокамер закрывают 1%-ным раствором агарозы при температуре 45-50^оС, а электрофоретическую камеру заполняют трис-ацетатным буферным раствором, рН 8,0 при этом напряженность составляет 700-1000 В/м и плотность тока 0,1-0,2 А/мм². Капилляры покрывают сверху буфером толщиной около 1 мм. При положительных результатах реакции в микрокамерах под малым увеличением через 2-3 мин от начала подачи напряжения и тока в пределах вышеуказанных параметров отмечают образование типичной картины гемагглютинации эритроцитов в виде крупных "хлопьев", состоящих из 12-15 красных кровяных тел, с полным просветлением фона по сравнению с равномерным распределением эритроцитов в объеме контрольных микрокамер, т.е. с контрольными диагностикумами.

На чертеже представлены графики зависимостей скорости формирования гемагглютинирующих комплексов от напряженности и плотности тока.

График 1 выражает зависимость скорости формирования типичной картины гемагглютинации в объеме опытной микрокамеры от напряженности, выраженной в В/м.

График 2 выражает зависимость скорости формирования типичной картины гемагглютинации в объеме опытной микрокамеры от плотности тока, выраженной в А/мм².

Выводы: при напряженности электрического поля в пределах 700-1000 В/м, плотности тока 0,1-0,2 А/мм² отмечена оптимальная зависимость формирования гемагглютинирующих комплексов от времени. Точки пересечения линий графиков 1 и 2 между собой и их протяженности в рамках определенных интервалов времени (2-3 мин) очерчивают геометрическую фигуру (заштрихованный сегмент) определенной площади, включающей совокупность наиболее оптимальных параметров напряженности, плотности тока и времени, используемых при осуществлении способа. Крайняя правая точка пересечения графиков 1 и 2 ограничивает максимальные значения параметров напряженности и плотности тока, превышение которых ведет к разрушению гемагглютинирующих комплексов.

Таким образом, в электрическом поле под действием электродвижущих сил, возникающих в электрическом поле за счет наличия поверхностных зарядов у эритроцитов диагностикумов и у антигенов, ускоряются контакты видоспецифических антител и антигенов, происходит сокращение сроков учета результатов реакции, а следовательно, и диагностирования. Кроме того, не исключено, что в электрическом поле возникает усиление взаимодействия именно видоспецифических антител и антигенов.

Способ индикации бактериальных антигенов поясняется следующими примерами с использованием в качестве объектов исследования приготовленных и зараженных клетками вакцинного штамма Y. pestis EV смывов с поверхности и применением диагностикума 2,5% чумных иммуноглобулиновых эритроцитов.

П р и м е р 1. К исследуемому материалу смыву с поверхности, зараженному клетками вакцинного штамма Y. pestis EV в концентрации 0,20 ^.10⁷ мк/мл, для обеззараживания добавляли 1% формалина. Смыв с поверхности в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор, рН 8,0, и титровали материал в 6 лунках. В каждую лунку с раститрованным исследуемым материалом вносили по одной капле 2,5%-ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины равномерно суспендировали в жидкости. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно также вносили трис-ацетатный буферный раствор в указанном объеме. Стеклянные капиллярные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальный столик электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий микрокамер, т.е. капилляров, в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буферном растворе, рН 8,0 при температуре 47^оС. Горизонтальную электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором рН 8,0, устанавливали на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры толщиной около 1 мм. Напряжение на электродах электрофоретической камеры составило 600 В/м при плотности тока 0,1 А/мм². Учет реакции производили через 3 мин и при этом в поле зрения каждого из шести капилляров не отмечали образования "хлопьев" в виде плотных скоплений эритроцитов в количестве 12-15 с просветлением фона. Дальнейшее увеличение времени наблюдения сопровождалось изменениями в картине гемагглютинации эритроцитов, которые отчетливо появлялись после 4 мин наблюдения в поле зрения каждого капилляра, при этом в капиллярах, приготовленных из лунок с концентрацией микробов 62 тыс. мк/мл и 31 тыс. мк/мл, отмечали участки, в полях зрения которых были четко выраженные гемагглютинаты.

В поле зрения, установленным на капилляре, содержащем контрольные эритроциты с наибольшей концентрацией антигенов 0,20 ^.10⁷ мк/мл в трис-ацетатном буферном растворе из расчета по одной капле 2,5%-ной концентрации в 0,4 мл, в течение 3 мин и более длительного до 30 мин наблюдения с подачей электрического поля с указанными напряженностью и током изменений в картине распределения эритроцитов не отмечали.

Достоверность учета положительного результата гемагглютинации в электрическом поле в капиллярных трубках проверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Смыв с поверхности в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластинки, содержащую 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор, рН 8,0 и титровали материал в шести лунках. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным исследуемым материалом вносили по одной капле 2,5% -ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины равномерно суспендировали в жидкости. Стеклянные капиллярные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальный столик электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий микрокамер, т.е. капилляров, в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1,0%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буферном раствор, рН 8,0 при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором, рН 8,0, устанавливали ее на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1 мм, напряженность на электродах составили 600 В/м, в плотность тока 0,1 А/мм². Учет реакции производили через 2,5 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров не отмечали образования "хлопьев" в виде плотных скоплений эритроцитов в количестве 12-15 с просветлением фона. Эритроциты располагались равномерно по всему полю зрения. Дальнейшее увеличение времени наблюдения не сопровождалось изменениями, в том числе и в картине расположения контрольных эритроцитов (т.е. в реакции взаимодействия контрольного диагностикума с исследуемым материалом).

Для контроля предлагаемого способа индикации бактериальных антигенов с указанными выше параметрами электрического поля-напряженности 600 В/м и плотности тока 0,1 А/мм² смыв с поверхности, зараженный клетками вакцинного штамма Y. pestis EV, исследовали с помощью РПГА. В качестве диагностикума использовали 2,5% -ные чумные иммуноглобулиновые эритроциты. Смыв с поверхности предварительно обеззаразили добавлением 1,0% формалина. Затем исследуемый материал в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины и титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Концентрация микробных клеток в смыве составляла 0,20 ^.10⁷ мк/мл, соответственно в последней шестой лунке находилось 31 тыс. мк/мл. Учет контрольной РПГА производили через 2 ч. При этом в первых трех лунках отметили положительные результаты с оценкой (++++). В четвертой лунке эритроциты равномерно покрывали более 2/3 площади поверхности днища лунки, что допустимо оценивать со знаком (++++), и где концентрация клеток составила 125 тыс. мк/мл, что соответствует чувствительности, указанной изготовителем. Достоверность учета положительного результата РПГА проверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного в тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Материал, подлежащий исследованию, в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Учет производили через 2 ч. При этом во всех лунках отмечено образование "пуговиц". В контрольных лунках РПГА, т.е. тех, где были добавлены контрольные эритроциты, также отмечено образование "пуговиц", т.е. эритроциты скатились к центру.

Вывод: данный пример демонстрирует сокращение сроков учета реакции гемагглютинации в электрическом поле до 4 мин при напряженности 600 В/м и плотности тока 0,1 А/мм² с одновременным повышением чувствительности до 31 тыс. мк/мл, однако время проведения реакции достаточно продолжительное. При постановке реакции в электрическом поле с вышеуказанными параметрами и исследовании смыва, незараженного клетками Y.pestis EV, картины изменения расположения эритроцитов в поле зрения не отмечено. В РПГА, поставленной для контроля достоверности учета с материалом, незараженным клетками Y.pestis EV, получены отрицательные результаты.

П р и м е р 2. К исследуемому материалу смыву с поверхности, зараженному клетками вакцинного штамма Y.pestis EV в концентрации 0,20^. 10⁷ мк/мл, для обеззараживания добавляли 1,0% формалина. Смыв с поверхности в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор рН 8,0, и титровали в шести лунках. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным исследуемым материалом вносили по одной капле 2,5% -ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины равномерно суспендировали в жидкости. Стеклянные капиллярные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальный столик электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий капилляров в направлении к электродам. Торцевые отверстия микрокамер, т.е. капилляров, закрывали 1,0%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буферном растворе, рН 8,0 при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором, рН 8,0, устанавливали на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1 мм. На электродах электрофоретической камеры напряженность составляла 700 В/м при плотности тока 0,1 А/мм². Учет реакции производили через 3 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров отмечали образование "хлопьев" в виде плотных скоплений эритроцитов в количестве 12-15 с просветлением фона. При этом в капиллярах, заполненных из лунок с концентрацией микробных клеток 62 тыс.мк/мл и 31 тыс. мк/мл, отмечали образование четко выраженных гемагглютинатов не по всей длине капилляров, а только на отдельных участках, что, вероятно, связано с ограниченным количеством антигена. Дальнейшее увеличение времени наблюдения не сопровождалось изменениями в картине гемагглютинации эритроцитов. В поле зрения, установленном на капилляре, содержащем контрольные эритроциты в трис-ацетатном буфере из расчета по одной капле 2,5%-ной концентрации, внесенной в 0,4 мл, в течение 3 мин и более длительного наблюдения при напряженности электрического поля 700 В/м и плотности тока 0,1 А/мм² видимых изменений в картине распределения эритроцитов не произошло, т.е. последние оставались равномерно расположенными по всему объему капилляра.

Достоверность учета положительного результата гемагглютинации в электрическом поле в капиллярных трубках проверяли при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Смыв с поверхности в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластинки, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор рН 8,0, и титровали в шести лунках. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным материалом вносили по одной капле 2,5%-ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины суспендировали в жидкости. Стеклянные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальный столик электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий микрокамер, т.е. капилляров в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1,0%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буферном растворе рН 8,0 при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором, рН 8,0, устанавливали ее на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1 мм, напряженность на электродах составила 700 В/м, а плотность тока 0,1 А/мм².

Учет реакции производили через 2,5 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров не отмечали образования "хлопьев" в виде плотных скоплений эритроцитов в количестве 12-15 с просветлением фона. Эритроциты располагались равномерно по всему полю зрения. Дальнейшее увеличение времени наблюдения не сопровождалось изменениями, в том числе и в картине расположения контрольных эритроцитов (т. е. в реакции взаимодействия контрольных диагностикумов с исследуемым материалом).

Для контроля предлагаемого способа индикации бактериальных антигенов, выполненного с использованием вышеуказанных параметров электрического поля, была поставлена РПГА, в которой в качестве исследуемого материала использовали смыв с поверхности, приготовленный при тех же условиях и зараженный клетками вакцинного штамма Y.pestis EV в концентрации 0,20^. 10⁷ мк/мл. Материал, подлежащий исследованию, предварительно обеззаразили добавлением 1,0% формалина, затем в объеме 0,4 мл последний вносили в начальную лунку полистироловой пластины и титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Концентрация микробных клеток в последней лунке составляла 31 тыс.мк/мл. Учет контрольной РПГА производили через 2 ч. При этом в первых трех лунках отметили положительный результат с оценкой (++++). В четвертой лунке эритроциты равномерно покрывали 2/3 площади поверхности днища лунки, что допустимо оценивать со знаком (++++), и где концентрация микробных клеток составила 125 тыс.мк/мл, как указана изготовителем чувствительность диагностикума.

Достоверность учета положительного результата РПГА проверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Материал, подлежащий исследованию, в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины и титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Учет реакции производили через 2 ч. При этом во всех лунках отмечено образование "пуговиц". В контрольных лунках РПГА (т.е. где были добавлены контрольные эритроциты) также отмечено образование "пуговиц", т.е. эритроциты скатились к центру.

Вывод: данный пример демонстрирует сокращение сроков учета реакции гемагглютинации в электрическом поле до 3 мин при напряженности 700 В/м и плотности тока 0,1 А/мм² с одновременным повышением чувствительности до 31 тыс. мк/мл, времени проведения реакции в данном случае достаточно продолжительное. При постановке реакции в электрическом поле с вышеуказанными параметрами и исследовании смыва, незараженного клетками Y.pestis EV, картины изменения равномерного расположения эритроцитов в поле зрения не обнаружено. В РПГА, поставленной для контроля достоверности учета с материалом, незараженным клетками вакцинного штамма Y.pestis EV, получены отрицательные результаты.

П р и м е р 3. К исследуемому материалу смыву с поверхности, зараженному клетками вакцинного штамма Y.pestis EV в концентрации 0,20 ^.10⁷ мк/мл, для обеззараживания добавляли 1,0% формалина. Смыв с поверхности в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор, рН 8,0, и титровали материал в шести лунках. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным исследуемым материалом вносили по одной капле 2,5%-ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины равномерно суспендировали в жидкости. Стеклянные капиллярные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальный столик электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий микрокамер, т.е. капилляров, в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1,0%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буфере, рН 8,0 при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором, рН 8,0, устанавливали ее на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1 мм, напряженность на электродах электрофоретической камеры составили 850 В/м при плотности тока 0,15 А/мм². Учет реакции проводили через 2,5 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров отмечали образование "хлопьев" в виде плотных скоплений эритроцитов в количестве 12-15 с просветлением фона. При этом в капиллярах, заполненных из лунок с концентрацией микробных клеток 62 тыс. мк/мл и 31 тыс.мк/мл, отмечали образование четко выраженных гемагглютинатов не по всей длине капилляров, а только на отдельных участках, что связано с ограниченным количеством антигенов. Дальнейшее увеличение времени наблюдения не сопровождалось изменениями в картине гемагглютинации эритроцитов. В поле зрения, установленном на капилляре, содержащем контрольные эритроциты в трис-ацетатном буферном растворе из расчета по одной капле их 2,5%-ной концентрации, внесенной в 0,4 мл, в течение 3 мин и более длительного наблюдения не отмечены изменения в картине равномерного распределения эритроцитов по объему капилляра при напряженности 850 В/м и плотности тока А/мм².

Достоверность учета положительного результата геммаглютинации в электрическом поле в капиллярных трубках проверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Смыв с поверхности в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластинки, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор, рН 8,0 и титровали в шести лунках. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным исследуемым материалом вносили по одной капле 2,5% -ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины равномерно суспендировали в жидкости. Стеклянные капиллярные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальный столик электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий микрокамер, т.е. капилляров, в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1,0%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буферном растворе, рН 8,0, при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором, рН 8,0, устанавливали ее на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1 мм, напряженность на электродах составила 850 В/м, а плотность тока 0,15 А/мм².

Учет реакции производили через 2,5 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров не отмечали образования "хлопьев" в виде плотных скоплений эритроцитов в количестве 12-15 с просветлением фона. Эритроциты располагались равномерно по всему полю зрения. Дальнейшее увеличение времени наблюдения не сопровождалось изменениями, в том числе и в картине расположения контрольных эритроцитов, т.е. в реакции взаимодействия контрольных диагностикумов с исследуемым материалом.

Для контроля предлагаемого способа индикации бактериальных антигенов, выполненного с использованием вышеуказанных параметров электрического поля, была поставлена РПГА, в которой в качестве исследуемого материала использовали смыв с поверхности, приготовленный при тех же условиях и зараженный клетками вакцинного штамма Y.pestis EV в концентрации 0,20 ^.10⁷ мк/мл. Материал, подлежащий исследованию, предварительно обеззаразили добавлением 1,0% формалина, затем в объеме 0,4 мл его вносили в начальную лунку полистироловой пластины и титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Концентрация микробных клеток в последней лунке составляла 31 тыс.мк/мл. Учет контрольной РПГА производили через 2 ч. При этом в первых трех лунках отметили положительный результат с оценкой (++++). В четвертой лунке эритроциты равномерно покрывали 2/3 площади поверхности днища лунки, что допустимо оценивать со знаком (++++), и где концентрация микробных клеток составила 125 тыс.мк/мл, что соответствует чувствительности диагностикума, указанной изготовителем.

Достоверность учета положительного результата РПГА проверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Материал, подлежащий исследованию, в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины и титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Учет реакции производили через 2 ч. При этом во всех лунках отмечено образование "пуговиц". В контрольных лунках РПГА, т.е. тех, где были внесены контрольные эритроциты, также отмечено образование "пуговиц", эритроциты скатились к центру.

Вывод: данный пример демонстрирует сокращение сроков учета реакции гемагглютинации в электрическом поле до 2,5 мин при напряженности 850 В/м и плотности тока 0,15 А/мм² с одновременным повышением чувствительности до 31 тыс. мк/мл. Время проведения реакции в данном случае непродолжительное. При постановке реакции в электрическом поле с вышеуказанными параметрами и исследовании смыва, незараженного клетками Y.pestis EV, картины изменения равномерного расположения эритроцитов в поле зрения не обнаружено. В РПГА, поставленной для контроля достоверности учета с материалом, незараженным клетками Y.pestis EV, получены отрицательные результаты.

П р и м е р 4. К исследуемому материалу смыву с поверхности, зараженному клетками вакцинного штамма Y.pestis EV в концентрации 0,20 ^.10⁷ мк/мл, для обеззараживания добавляли 1,0% формалина. Смыв с поверхности в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор, рН 8,0, и титровали материал в шести лунках. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным исследуемым материалом вносили по одной капле 2,5%-ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины равномерно суспендировали в жидкости. Стеклянные капиллярные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальный столик электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий микрокамер, т.е. капилляров, в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1,0%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буфере, рН 8,0 при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором, рН 8,0, устанавливали ее на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1 мм, напряженность на электродах электрофоретической камеры составила 1000 В/м при плотности тока 0,2 А/мм². Учет реакции проводили через 2,0 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров отмечали образование "хлопьев" в виде плотных скоплений эритроцитов в количестве 12-15 с просветлением фона. При этом в капиллярах, заполненных из лунок с концентрацией микробных клеток 62 тыс. мк/мл и 31 тыс.мк/мл, отмечали образование четко выраженных гемагглютинатов не по всей длине капилляров, а только на отдельных участках, что связано с ограниченным количеством антигенов. Дальнейшее увеличение времени наблюдения не сопровождалось изменениями картины гемагглютинировавших эритроцитов. В поле зрения, установленном на капилляре, содержащем контрольные эритроциты с наибольшей концентрацией антигенов в данных опытах 0,20 ^.10⁷ мк/мл в трис-ацетатном буферном растворе из расчета одна капля 2,5%-ных контрольных эритроцитов в 0,4 мл, в течение 2 мин и более длительного наблюдения с подачей электрического поля напряженностью 1000 В/м и плотностью тока 0,2 А/мм² видимых изменений в картине равномерного распределения эритроцитов не отмечали, т.е. последние оставались равномерно расположенными по всему объему капилляра.

Достоверность учета положительного результата гемагглютинации в электрическом поле в капиллярных трубках проверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Смыв с поверхности в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластинки, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор, рН 8,0, и титровали в шести лунках. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным материалом вносили по одной капле 2,5% -ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины равномерно суспендировали в жидкости. Стеклянные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальной поверхности столика электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий микрокамер, т.е. капилляров, в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1,0%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буферном растворе рН 8,0 при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором с рН 8,0, устанавливали ее на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1 мм, напряженность на электродах составила 1000 В/м, а плотность тока 0,2 А/мм². Учет реакции производили через 2 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров не отмечалось образования "хлопьев" в виде плотных скоплений эритроцитов в количестве 12-15 с просветлением фона. Эритроциты располагались равномерно по всему полю зрения. Дальнейшее увеличение времени наблюдения не сопровождалось изменениями, в том числе и в картине расположения контрольных эритроцитов, т. е. в реакции взаимодействия контрольных диагностикумов с исследуемым материалом.

Для контроля предлагаемого способа индикации бактериальных антигенов, выполненного с указанными выше параметрами, напряженность 1000 В/м и плотность тока 0,2 А/мм², была поставлена РПГА, в которой в качестве исследуемого материала использовали смыв с поверхности, зараженный клетками вакцинного штамма Y. pestis EV в концентрации 0,20 ^.10⁷ мк/мл. Материал, подлежащий исследованию, предварительно обеззараживали путем добавления 1,0% формалина, затем в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины и титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Концентрация микробных клеток в последней лунке составляла 31 тыс.мк/мл. Учет контрольной РПГА производили через 2 ч. При этом в первых трех лунках отметили положительный результат с оценкой (++++). В четвертой лунке эритроциты равномерно покрывали более 2/3 площади поверхности днища лунки, что допустимо оценивать со знаком (++++), и где концентрация клеток составила 125 тыс.мк/мл, что соответствует чувствительности, указанной изготовителем. В контрольных лунках РПГА, т. е. в лунках с максимальной концентрацией антигенов в данных опытах 0,20^. 10⁷ мк/мл и внесенной одной каплей 2,5%-ных контрольных эритроцитов в 0,4 мл физраствора, отмечено образование "пуговиц", т.е. эритроциты скатились к центру.

Достоверность учета положительного результата РПГА поверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Материал, подлежащий исследованию, в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Учет РПГА производили через 2 ч. При этом во всех лунках отмечено образование "пуговиц", т.е. эритроциты скатились к центру.

Вывод: данный пример демонстрирует сокращение сроком учета реакции гемагглютинации в электрическом поле до 2 мин при напряженности 1000 В/м и плотности тока 0,2 А/мм² с одновременным повышением чувствительности до 31 тыс.мк/мл. Время протекания реакции в данном случае максимально короткое, т. е. можно считать предельно достижимое. При постановке реакции в электрическом поле с вышеуказанными параметрами и исследовании смыва, не зараженного клетками вакцинного штамма Y. pestis EV, картины изменения равномерного расположения эритроцитов в поле зрения не отмечено.

П р и м е р 5. К исследуемому материалу смыву с поверхности, зараженному клетками вакцинного штамма Y.pestis EV в концентрации 0,20^. 10⁷ мк/мл, для обеззараживания добавляли 1,0% формалина. Смыв с поверхности в объеме 0,4 л вносили в начальную лунку полистироловой пластины, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор, рН 8,0, и титровали материал в шести лунках полистироловой пластины. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным исследуемым материалом вносили по одной капле 2,5%-ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легкого сотрясения пластины равномерно суспендировали в жидкости. Стеклянные капилляры длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым из каждой лунки и укладывали на горизонтальной поверхности столика электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий капилляров в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1,0% -ной агарозой в трис-ацетатном буферном растворе с рН 8,0 при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буфером рН 8,0, устанавливали ее на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов, т.е. капилляров, эритроциты и под малым увеличением вели наблюдение. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1,0 мм. Напряженность на электродах камеры составляла 1100 В/м при плотности тока 0,25 А/мм². Учет результатов реакции проводили через 2 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров отмечали беспорядочное смещение всей массы эритроцитов в направлении к одному из полюсов, т.е. электродов, при этом образования гемагглютинатов ни в одном из капилляров не отмечали. Дальнейшее увеличение времени наблюдения сопровождалось уплотнением сместившейся массы в направлении к одному из электродов. Следует отметить, что в течение первых 1,5 мин наблюдения также не происходит формирования гемагглютинатов в виде "хлопьев". В поле зрения, установленном на капилляре, содержащем контрольные эритроциты с наибольшей концентрацией антигенов в данных опытах 0,20 ^.10⁷ мк/мл, при наблюдении в течение 2 мин с применением вышеуказанных параметров электрического поля также отмечается смещение массы эритроцитов к одному из полюсов.

Достоверность учета положительного результата гемагглютинации в электрическом поле в капиллярных трубках проверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Смыв с поверхности объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, содержащей 0,4 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали трис-ацетатный буферный раствор, рН 8,0, и титровали материал в шести лунках. Во флакон с сухим эритроцитарным диагностикумом предварительно вносили трис-ацетатный буфер в указанном объеме. В каждую лунку с раститрованным исследуемым материалом вносили по одной капле 2,5% -ных чумных иммуноглобулиновых эритроцитов, которые путем легких сотрясений пластины равномерно суспендировали в жидкости. Стеклянные капиллярные трубки длиной 10-15 мм поочередно заполняли содержимым каждой лунки и укладывали на горизонтальный столик электрофоретической камеры с ориентацией торцевых отверстий микрокамер, т.е. капилляров, в направлении к электродам. Торцевые отверстия капилляров закрывали 1,0%-ным раствором агарозы в трис-ацетатном буферном растворе, рН 8,0, при температуре 47^оС. Электрофоретическую камеру заполняли трис-ацетатным буферным раствором рН 8,0, устанавливали ее на предметный столик микроскопа, находили в поле зрения исследуемых объектов (капилляров) эритроциты под малым увеличением. При этом буферный раствор покрывал капилляры слоем толщиной около 1 мм, напряженность на электродах составила 1100 В/м, а плотность тока 0,25 А/мм². Учет результатов реакции проводили через 2 мин, при этом в поле зрения каждого из шести капилляров отмечали беспорядочное смещение всей массы эритроцитов к одному из полюсов. В поле зрения, установленном на капилляре, содержащем контрольные эритроциты с наибольшей концентрацией антигенов данных опытах 0,2 ^.10⁷ мк/мл, при наблюдении в течение 2 мин с применением вышеуказанных параметров электрического поля также отмечается смещение массы эритроцитов к одному из полюсов.

Для контроля предлагаемого способа индикации бактериальных антигенов была поставлена РПГА, в которой в качестве исследуемого материала использовали смыв с поверхности, зараженный клетками вакцинного штамма Y.pestis EV в концентрации 0,2^. 10⁷ мк/мл. Материал, подлежащий исследованию, предварительно обеззаразили путем добавления 1,0% формалина, затем в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины и титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Концентрация микробных клеток в последней лунке составила 31 тыс.мк/мл. Учет РПГА производили через 2 ч. При этом в первых трех лунках отметили положительный результат с оценкой (++++). В четвертой лунке эритроциты равномерно покрывали более 2/3 площади поверхности днища лунки, что допустимо оценивать со знаком (++++), где концентрация клеток составила 125 тыс.мк/мл, что соответствует чувствительности, указанной изготовителем. В контрольных лунках РПГА, т.е. в лунках с максимальной концентрацией антигена, использованного в данных опытах, 0,2^. 10⁷ мк/мл и внесенной одной каплей 2,5% -ных контрольных эритроцитов, отмечали образование "пуговиц", эритроциты скатились к центру лунки.

Достоверность учета положительного результата РПГА проверили при исследовании материала смыва с поверхности, приготовленного при тех же условиях, но не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV. Материал, подлежащий исследованию, в объеме 0,4 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, титровали в шести лунках в физиологическом растворе. Учет РПГА проводили через 2 ч. При этом во всех лунках отмечено образование "пуговиц". В контрольных лунках РПГА, т.е. где были добавлены контрольные эритроциты, также отмечено образование "пуговиц" эритроциты скатились к центру лунки.

Вывод: данный пример демонстрирует невозможность дальнейшего сокращения времени реакции в электрическом поле, так как при напряженности 1100 В/м и плотности тока 0,25 А/мм² отмечали полное разрушение картины распределения эритроцитов в капиллярах с опытными и контрольными диагностикумами, что свидетельствует в пользу применения ограниченных параметров электрического поля в пределах напряженности 700-1000 В/м и плотности тока 0,1-0,2 А/мм² для получения положительного эффекта. При постановке реакции в капиллярах в электрическом поле напряженностью 1100 В/м и плотностью тока 0,25 А/мм² и исследовании материала смыва с поверхности, не зараженного клетками вакцинного штамма Y.pestis EV, отмечено беспорядочное смещение массы эритроцитов к одному из полюсов. В РПГА, поставленной для контроля достоверности учета с материалом, не зараженным клетками Y/pestis EV, получены отрицательные результаты.

Следует отметить, что результаты контролей опытов во всех примерах, за исключением 5, полностью коррелируют с таковыми, полученными в РПГА.

Для подтверждения положительного эффекта предлагаемого способа индикации бактериальных антигенов путем проведения реакции в электролите и в электрическом поле при напряженности 700-1000 В/м и плотности тока 0,1-0,2 А/мм² кроме чумных иммуноглобулиновых эритроцитов были испытаны холерные и бруцеллезные иммуноглобулиновые эритроциты на примерах обнаруживания соответствующих антигенов в смывах с поверхности. Кроме того, на примере исследования сывороток от иммунизированных животных (имитировавших материал от больных) были испытаны чумные и туляремийные антигенные эритроцитарные диагностикумы. При этом время учета сократилось до 2-3 мин, а точность (чувствительность) предлагаемого способа индикации бактериальных антигенов по сравнению с общеизвестной методикой постановки РПГА повышалась до 4 раз. На основании примеров показано преимущество способа индикации бактериальных антигенов путем проведения реакции в электролите и в электрическом поле по сравнению с известным способом обнаруживания бактериальных антигенов с помощью РПГА.

Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: индикацию бактериальных антигенов осуществляют поставкой реакции пассивной гемагглютинации смешиванием исследуемого антигена с эритроцитарным диагностикумом в реакционной среде. В качестве реакционной среды используют электролит, смесь эритроцитарного диагностикума и исследуемого антигена помещают в микрокамеру, изолируют от электролита агарозой, микрокамеру располагают в электролите изолирующими проводниками перпендикулярно направленности электрического поля реакцию, проводят при напряженности электрического поля 700 - 1000 В/м и плотности тока 0,1-0,2 А/мм², а учет результатов ведут под малым увеличением микроскопа. 1 ил.

СПОСОБ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ, включающий постановку реакции пассивной гемагглютинации смешиванием исследуемого антигена с эритроцитарным диагностикумом в реакционной среде и учет результатов реакции, отличающийся тем, что в качестве реакционной среды используют электролит, смесь эритроцитарного диагностикума и исследуемого антигена, помещают в микрокамеру, изолируют от электролита агарозой, микрокамеру располагают в электролите изолирующими проводниками перпендикулярно направленности электрического поля, реакцию проводят при напряженности электрического поля 700 1000 В/м и плотности тока 0,1 0,2 А/мм², а учет результатов ведут под малым увеличением микроскопа.