СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФФИННОСТИ АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунологическому анализу, а именно к анализу биоспецифического связывания с помощью серологических реакций.

Изменение стандартной свободной энергии при взаимодействии биологических молекул, например антител и антигенов, может быть охарактеризовано разностью между энергией реагирующих веществ и энергией продуктов реакции /Мусил Я., Новакова О. , Кунц К. Современная биохимия в схемах. М., Мир. - 1984. - с. 16/.

Силы связывания антител и антигенов, в зависимости от типов последних, характеризуют терминами авидность и аффинность. Причем авидность определяется связыванием гетерогенных антител, получаемых в антигенной детерминанте, в сыворотке и гетерогенностью этих детерминант. На проявление авидности антисыворотки к антигену усиливающий эффект оказывает поливалентность последнего. Аффинность характеризует взаимодействие антител с моновалентным гаптеном или с одной антигенной детерминантой (Ройт А. Основы иммунологии. - М. : Мир, 1991, с.69-70).

Аффинность можно определить как сумму межмолекулярных сил притяжения и отталкивания, возникающих при взаимодействии антигенсвязывающего центра антитела и гомологической детерминанты /Глинн Л. , Стьюард М. Структура и функции антител. - М.: Мир, 1983, с.114/.

Известные методы определения аффинности связаны с ограничением гетерогенности антител, предотвращением образования необратимых комплексов в обратимых реакциях с гаптенами, точном измерении концентраций свободного и связанного с антителом гаптена (в молях). Анализ значений аффинности антител, определяемых с помощью различных методов, не дает единых величин и показывает относительно широкое колебание их точности. Энергия взаимодействия антител и гаптенов может быть определена математически на основании определения константы аффинности "К". Связь между двумя частицами наиболее оптимально может быть определена через энергию, изменение которой сопровождается образованием аддукта (т. е. новой комбинационной молекулы) (Иммунологические методы. Под ред. Фриммель Г.М. Медицина, 1987, с.43-55).

Однако все эти известные методы недостаточно точны, трудоемки, используются для гаптенов и непригодны для нативных молекул в силу их недостаточной диссоциации, что в конечном итоге затрудняет контроль производства бактериальных препаратов.

Наиболее близким по существу к заявляемому изобретению является способ определения аффинности антител путем измерения гашения флюоресценции (Иммунологические методы. /Под ред. Фриммель Г. - М.: Медицина, 1987, с. 50-55).

Способ осуществляется следующим образом. В термостатируемую кювету флюориметра вносят 1 мл раствора антител. После стабилизации температуры образец облучают УФ светом с длиной волны 280-295 нм. В полученные данные вводят поправку на флюоресценцию растворителя. Раствор антител облучают УФ светом только во время измерения флюоресценции. Раствор гаптена добавляют вначале порциями по 10 мкл, затем по 20 мкл до тех пор, пока объем добавленного гаптена не достигнет 200 мкл. Концентрация Е-ДНФ-1-лизина должна составлять 10^-5М. После каждого прибавления гаптена измеряют интенсивность флюоресценции (Q_i), предварительно интенсивно перемешав смесь. Для оценки связывания необходимо определить максимальное гашение флюоресценции (Q_max) для каждого препарата антител. Насыщение участков связывания антител устанавливают титрованием 1•10^-3М раствора гаптена. Получаемое при такой концентрации гаптена гашение флюоресценции должно быть откорректировано параллельным титрованием иммуноглобулинов. Титрование проводят до молярного избытка гаптена, равного 200:1 к участкам связывания антител. При этом практически все участки связывания оказываются "занятыми". Дальнейшее увеличение концентрации гаптена не увеличивает специфического гашения флюоресценции.

К числу недостатков способа следует отнести неудобства, связанные с использованием высокоочищенных антител и ограниченного круга гаптенов. Данные, полученные при гашении флюоресценции, недостаточно точны, поскольку определение аффинности основано на вторичном феномене связывания гаптена с антителами.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение точности определения аффинности антител за счет учета потенциальной энергии физических носителей при минимальном количестве антител, формирующих положительные результаты в серологической реакции.

Поставленная цель достигается тем, что аффинность антител определяют при постановке серологической реакции. Подготовку раствора антител осуществляют титрованием исследуемой сыворотки с коэффициентом 1:1,1 в пределах значений сывороточной единицы 0,66-1,0, а учет результатов реакции проводят по ее положительным результатам, при этом к аффинным относят антитела при величине потенциальной энергии связывания физических носителей 1,8-2,6•10^-4 Дж/м³.

По отношению к прототипу заявляемый объект имеет следующие отличительные признаки.

Постановка серологической реакции, в которой используют нативные молекулы иммуноглобулинов, а не синтезированные молекулы гаптенов, что позволяет учитывать ее результаты в условиях, идентичных к взаимодействию антител и антигенов в реакции агглютинации.

Уменьшенный коэффициент титрования сыворотки 1:1,1, что позволяет более точно находить границу перехода положительных результатов в отрицательные.

Проведение визуального учета результатов реакции по величине потенциальной энергии массы физических носителей на наклонной поверхности днища лунки, которая для 30 мкл 2,5%-ной суспензии эритроцитов в 0,5 мл лунке в положительных случаях, т. е. , при образовании "зонтиков" составляет 0,9-1,3•10^-10 Дж, что соответствует энергии на 1 м³ в системе единиц СИ 1,8-2,6•10^-4 Дж/м³.

Потенциальную энергию физических носителей определяют по формуле E=mgh, где E - потенциальная энергия, m - масса суспендированных носителей, равная разнице плотности самих носителей и разводящей жидкости, g - ускорение свободного падения 9,82 м/с², h - средняя высота расположения массы носителей на наклонной поверхности днища лунки.

Силы связывания антител и антигенов по своей сути носят комплексный характер, складывающийся в результате образования водородных связей, неполярного (гидрофобного) связывания, ионных взаимодействий, Вандерваальсовых сил, стерических сил отталкивания (Глинн Л., Стьюард М. Структура и функции антител. - М.: Мир, 1983, с.114-115).

Таким образом, достигается упрощение способа с одновременным повышением точности определения аффинности антител в условиях, более приближенных к естественным.

Возможность практического осуществления заявляемого изобретения с использованием полной совокупности заявляемых признаков подтверждается примерами конкретного исполнения способа.

Пример 1. Раствор иммуноглобулинов с концентрацией, соответствующей 0,66 сывороточной единицы, титруют с коэффициентом 1:1,1 в 0,5 мл физраствора в двух рядах по две лунки полистироловой пластины. В каждую лунку первого ряда вносят по 30 мкл 2,5%-ного эритроцитарного чумного антигенного диагностикума. В каждую лунку второго ряда вносят по 30 мкл 2,5%-ной концентрации контрольные эритроциты. Учет проводят через 4 часа по наличию в первой лунке опытного ряда типичной картины образования "зонтиков", площадь которого составила 2/3 площади поверхности днища лунки, и образованию во второй лунке "зонтика" меньшей площади. В двух лунках контрольного ряда отметили образование "пуговки".

При этом суммарная потенциальная энергия физических носителей при образовании "зонтика" с площадью, равной 2/3 площади днища лунки с 0,5 мл физраствора, 30 мкл 2,5%-ной концентрацией эритроцитов и содержанием иммуноглобулинов, равным 0,66 сывороточной единицы, соответствует 1,8•10^-4 Дж/м³.

Пример 2. Раствор иммуноглобулинов с концентрацией, соответствующей 0,83 сывороточной единицы, вносят в первые 2 лунки и титруют с коэффициентом 1: 1,1 в 0,5 мл физраствора в двух рядах по 2 лунки полистироловой пластины. В каждую лунку первого ряда вносят по 30 мкл 2,5%-ного эритроцитарного чумного антигенного диагностикума. В каждую лунку второго ряда вносят по 30 мкл 2,5%-ной концентрации контрольные эритроциты. Учет проводят через 4 часа по наличию в первой лунке опытного ряда типичной картины образования "зонтика", площадь которого составила 5/6 площади поверхности днища лунки, и образованию во второй лунке "зонтика" меньшей площади. В двух лунках контрольного ряда отметили образование "пуговки".

При этом суммарная потенциальная энергия физических носителей при образовании "зонтика" с площадью, равной 5/6 площади днища лунки в 0,5 мл физраствора, 30 мкл 2,5%-ной концентрацией эритроцитов и содержанием иммуноглобулинов, равным 0,83 сывороточной единицы, соответствует 2,2•10^-4 Дж/м³.

Пример 3. Раствор иммуноглобулинов с концентрацией, соответствующей 1,0 сывороточной единицы, вносят в первые 2 лунки и титруют с коэффициентом 1: 1,1 в 0,5 мл физраствора в двух рядах по 2 лунки полистироловой пластины. В каждую лунку первого ряда вносят по 30 мкл 2,5%-ного эритроцитарного чумного антигенного диагностикума. В каждую лунку второго ряда вносят по 30 мкл 2,5%-ной концентрации контрольные эритроциты. Учет проводят через 4 часа по наличию в первой лунке опытного ряда типичной картины образования "зонтика", площадь которого равна площади поверхности днища лунки и образованию во второй лунке "зонтика" меньшей площади. В двух лунках контрольного ряда отметили образование "пуговки".

При этом суммарная потенциальная энергия физических носителей при образовании "зонтика" с площадью, равной площади днища лунки в 0,5 мл физраствора, 30 мкл 2,5%-ной концентрацией эритроцитов и содержанием иммуноглобулинов, равным 1,0 сывороточной единицы, соответствует 2,6•10^-4 Дж/м³.

Выполнение примеров пояснено на графике, чертеж, где по оси абсцисс показано изменение концентрации иммуноглобулинов в сывороточных единицах, по оси ординат показаны результаты реакции, выраженные по величине площади "зонтиков" и соответствующей им потенциальной энергии в Дж на единицу объема.

Выполнение постановки, приведенной в примерах 1, 2, 3 реакции при значениях сывороточной единицы более 1,0 не проявляют изменений в картине образования типичных результатов задержки эритроцитов на наклонной поверхности днищ лунок в виде "зонтиков", площадь которых соответствует площади лунки. Выполнение постановки вышеуказанных реакций при значениях сывороточной единицы менее 0,66 дает образование "зонтиков" с площадью поверхности менее 2/3 поверхности днища лунки, которые оценивают как отрицательные результаты реакций.

При значениях потенциальной энергии связывания физических носителей менее 1,8 Дж/м³ аффинность недостаточна для суспендированного диагностикума или анализируемых антител, 2,6•10^-4 Дж/м³ - предельно достижимое значение потенциальной энергии иммуносуспензионной реакции.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит проводить точный контроль качества при производстве бактериальных диагностических препаратов, а также более просто и точно оценивать получение иммуноглобулинов по сравнению с известными способами. При этом повсеместное использование предлагаемого способа определения аффинности антител по суммарной потенциальной энергии физических носителей в границах заявляемых параметров позволяет получить биоэнергетические константы взаимодействия молекул антигенов и иммуноглобулинов.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммунологии, и позволяет упростить исследование, а также повысить точность определения аффинности антител. Аффинность антител определяют при постановке серологической реакции, подготовку раствора антител осуществляют титрованием исследуемой сыворотки с коэффициентом 1 : 1,1 в пределах значений сывороточной единицы 0,66 - 1,0, а учет результатов реакции проводят по ее положительным результатам, при этом к аффинным относят антитела при величине потенциальной энергии связывания физических носителей 1,8-2,6•10^-4 Дж/м³. 1 ил.

Способ определения аффинности антител, включающий постановку иммунологической реакции, подготовку антител, учет реакции, оценку аффинности, отличающийся тем, что ставят серологическую реакцию, подготовку раствора антител осуществляют титрованием исследуемой сыворотки с коэффициентом 1 : 1,1 при значениях сывороточной единицы 0,66 - 1,0, а учет результатов реакции проводят по ее положительным результатам, при этом к аффинным относят антитела при величине потенциальной энергии связывания физических носителей 1,8 - 2,6 • 10⁴ Дж/м³.