СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ АНТИГЕНОВ ВИРУСА КОРИ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/165 C12N7/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии и биотехнологии, и может быть использовано для получения новых иммуногенных и диагностических препаратов.

Получение и очистка поверхностных белков-антигенов является очень сложной задачей из-за наличия большого количества примесей и низкой концентрации вирусных частиц, несущих поверхностные белки.

Известен способ выделения и очистки самих вирусных частиц из культуральной жидкости (Karl Habel, Norman P. SaIzman, 1972). В данном случае метод крайне трудоемок и требует огромных материальных затрат для получения больших объемов культуральной жидкости. Для его использования требуется дорогостоящее лабораторное оборудование - высокоскоростные препаративные центрифуги. Кроме этого, метод ультрацентрифугирования вирусных частиц из культуральной среды приводит к значительным потерям как вирусных частиц, так и непосредственно к потере поверхностных белков-антигенов с поверхности выделяемых таким способом вирусных частиц.

Наиболее близким техническим решением будет способ получение фракции вирусных антигенов за счет дифференциального центрифугирования и повторного отмывания тканевых экстрактов. (Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях / Под ред. Синая Г.Я. и Биргера О.Г. - М.: Медгиз, 1949, с. 554)/
Задачей заявляемого изобретения является накопление специфического антигена в цитоплазматической мембране перевиваемых клеток, инфицированных вирусом кори и его выделение.

Поставленная задача достигается за счет получения антигенов вируса кори, путем заражения вирусом кори клеточного субстрата, при этом в качестве клеточного субстрата используют клеточную культуру Vero, затем проводят пассирование вируса через клеточную культуру, после пассирования выдерживают культуру при температуре 6-8^oС в течение 48-72 ч, а экстракцию антигенной фракции осуществляют с помощью 1,5-3% раствора октилгликопиранозида натрия с получением обогащенной фракции поверхностных антигенов вируса кори.

Способ осуществляется следующим образом.

Накопление вируса проводят стандартным способом в перевиваемой культуре клеток: монослой клеток (2-3-дневный) заражают вирусом кори из расчета 1 ЦПД на клетку. В работе используют штамм вируса кори БУК. При 70-80%-ном вирусном поражении клеточную культуру выдерживают в течение 2-3 суток при температуре 6-8^oС, что является основой обогащения цитоплазматической мембраны клеток поверхностными белками вируса кори. При понижении температуры репродукции вируса происходит накопление как гемагглютинина, так и других белков коревого вируса.

Важно отметить, что концентрация белка в цитоплазматическом экстракте растет медленнее, чем гемагглютинирующая (ГА) активность фракции, что позволяет сделать предположение о том, что при пониженной температуре репродукции происходит главным образом биосинтез поверхностных белков вируса кори.

Концентрацию белка определяют методом Lowry О.Н. (1951). Гемагглютинирующую активность полученных антигенных фракций и содержание противокоревых антител в контрольных образцах определяют в реакции гемагглютинации (РГА) и торможения гемагглютинации (РТГА) методом Norrby (1962).

Другой важной особенностью данного способа является использование 1-3%-ного раствора октилгликопироназида натрия для экстракции антигенной фракции вируса кори из зараженных клеток, который легко удаляется из экстракционной фракции путем диализа против физиологического раствора.

Разработанный способ без дополнительных затрат обогащает цитоплазматическую фракцию поверхностными белками вируса кори за счет пролонгированного культивирования инфицированных вирусом кори клеток при низких температурах (6-8^oС). При этом титр гемагглютинирующей активности полученных антигенов составляет 1:2560-1:5120. Для выделения цитоплазматической антигенной фракции используется детергент нового типа - октилглюкозопиронозида натрия.

Полученная таким образом цитоплазматическая фракция является нативным, специфичным, иммуногенным и высокоактивным коревым антигеном.

Специфичность полученного антигена проверена с отраслевым стандартным образцом коревых антител (ОСО), гипериммунными сыворотками к вирусу кори, вирусу паротита и вирусу краснухи (табл.1).

Из данных, представленных в табл. 1, следует, что гемагглютинирующая активность нейтрализуется антительными препаратами коревой специфичности, тогда как гипериммунные сыворотки к вирусам краснухи и паротита таким действием не обладают.

Иммуногенность полученного препарата проверяют в эксперименте: мышам BALb/C 2-кратно внутрибрюшинно вводят по 20 γ (по белку) исследуемого материала. Пул сывороток получают на 30-й день после последней иммунизации. Результаты тестирования сывороток в РТГА позволяют получать гипериммунную антисыворотку к вирусу кори с титром 1:512.

Отработка временных параметров пролонгированного культивирования и определение концентрации детергента проводят по схеме, представленной на примере.

Пример
На первом этапе проводят стандартный посев клеточной культуры Vero на пять 1,5-литровых матраса с концентрацией клеток 100 000 кл./мл. Через двое суток на клеточный монослой 4 флаконов вносят вирус кори штамм Бук из расчета 1ЦПД на клетку. Один матрас - контрольный; для подсчета клеток перед инфицированием. Ежедневно клеточную культуру просматривают под микроскопом и на 7-й день культивирования (при 70% поражении) матрасы снимают, три из которых помещают в холодильник (7^oС) на 24-48-72 ч. Инфицированные клетки одного матраса сразу же ресуспендируют в лизирующем буфере (0,01 М Трис -HCl рН 7,4; 0,1 NaCl; 0,001 М ЭДТА, 0.1% дезоксихолата натрия и 1,5% неионного детергента октигликопиранозида натрия) из расчета 1 мл буфера на 10-12 миллионов клеток и энергично перемешивают с помощью настольной качалки в течение 30 мин при комнатной температуре. К смеси добавляют ингибитор протеаз PMSF (в конечной концентрации 0,005%), далее клеточный дебрис осаждают путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30 мин. Концентрация белка в супернатанте - 2,5 мг/мл; титр гемагглютинирующей активности -1:80-1:160±. Объем полученного экстракционного материала равен 3 мл на 45 миллионов клеток.

Через 24-48-72 ч проводят то же самое с матрасами, помещенными в холодильник. Полученные результаты представлены в табл.2.

Таким образом, коревой антиген с наивысшей активностью (титр 1: 2560-1: 5120) может быть получен при использовании 1,5-3,0% детергента и 48-72 ч культивирования при 7^oC.

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии и биотехнологии, и может быть использовано для получения новых иммуногенных и диагностических препаратов. Сущностью способа является заражение вирусом кори клеточной культуры Vero, пассирование вируса через клеточную культуру, выдерживание культуры при температуре 6-8^oС в течение 48-72 ч, и экстракция антигенной фракции с помощью 1,5-3% раствора октилгликопиранозида натрия. Техническим результатом является получение обогащенной фракции поверхностных антигенов вируса кори 2 табл.

Способ получения антигенов вируса кори, включающий заражение вирусом кори клеточного субстрата, отличающийся тем, что в качестве клеточного субстрата используют клеточную культуру Vero, проводят пассирование вируса через клеточную культуру, после пассирования выдерживают культуру при температуре 6-8^oС в течение 48-72 ч, а экстракцию антигенной фракции осуществляют с помощью 1,5-3%-ного раствора октилгликопиранозида натрия с получением обогащенной фракции поверхностных антигенов вируса кори