СПОСОБ ОБРАБОТКИ ГИДРОЛИЗАТА ПЕРОКСИДАЗЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ФЕНОЛОВ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/08 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам гидролитического расщепления нативного комплекса фермент пероксидаза+фенолы (хиноны), которые могут найти применение при изучении различных метаболических процессов, связанных с действием пероксидазы процессы лигнификации тканей, защитные реакции организмов, иммунологические исследования, при которых используется пероксидаза.

Известен способ гидролиза пероксидазы гриба Inonotus radiatus, при котором выделенную фракцию фермента гидролизуют 6 н. соляной кислотой (HCl) в течение 12 ч при температуре 105^оС (Lobarzewski J. Homoprotein peroxidase from Inonotus radiatus. Acta Microbiologica Polonica, 1977, Vol. 26, N 2, р. 179-184). Затем проводят обработку гидролизата. Для этого упаривают в вакууме в среде аргона и восстанавливают образовавшиеся хиноны до фенолов в присутствии амальгамы натрия. Раствор охлаждают льдом, нейтрализуют серной кислотой (H₂SO₄) до рН 1. Полученные фенолы экстрагируют серным эфиром [1]
Недостатками указанного способа являются следующие
жесткие условия, а именно 6 н.HCl и кипячение в течение 12 ч, что приводит к разрушению фермента и частичному разрушению конечных продуктов фенолов, вследствие чего становится невозможным достаточно объективно судить о наборе фенолов и активности пероксидазы после их отщепления;
при упаривании гидролизата под вакуумом могут происходить разрушение и потери летучих хинонов, а также их повторное присоединение к остаткам полипептидов и аминокислот, что приведет к нивелированию данных при определении фенольных соединений. Длительное использование вакуума не предотвращает окисления хинонов из-за высокой реакционной способности;
применение серной кислоты вызывает разогрев гидролизата, а именно этого необходимо избегать, так как микроразогрев взаимодействующих молекул серной кислоты и воды приводит к необратимым изменениям оставшегося в гидролизате белка, полипептидов и фенолов. Серная кислота, как очень сильная, взаимодействующая с органическими соединениями гидролизата, может активно их изменять, нарушая общую картину результатов гидролиза.

Другие способы гидролиза комплекса пероксидаза+фенолы (хиноны) не известны.

Сущность изобретения состоит в способе гидролиза комплекса пероксидаза+фенолы (хиноны) и обработки гидролизата для исследования фенолов, включающем кислотный гидролиз, обработку гидролизата, восстановление хинонов с последующим анализом, а гидролиз проводят в 1 н. HCl в течение 0,5-6 ч, без упаривания под вакуумом и нейтрализацию ведут 1 н. HCl.

При осуществлении способа гидролиз ведется не более 6 ч. в 1 н. HCl. Затем гидролизат сразу нейтрализуют 1 н. щелочью до рН 10; добавляют 2,5%-ную амальгаму натрия и восстанавливают хиноны до фенолов при комнатной температуре, что обеспечивает сохранение легкоразрушимых и летучих фенольных соединений. Полученный раствор подкисляют 1 н. соляной кислотой до рН 1-2. Подкисление обеспечивает переход возможных фенолятов (солей натрия с фенолами) в свободные фенолы, которые экстрагируют органическими растворителями. Замена серной кислоты на соляную исключает негативное воздействие ионов SO₄^2- на органические соединения гидролизата.

Гидролиз комплекса пероксидаза+фенолы (хиноны) показан в примерах.

П р и м е р 1. 100 мг пероксидазы хрена помещают в стеклянную ампулу, добавляют 5 мл 1 н. HCl марки химически чистая, ампулу запаивают и нагревают при 105^оС в течение 5 мин. Затем ампулу вскрывают, гидролизат сразу подщелачивают 1 н. раствором щелочи натрия до рН 10. К раствору добавляют 20 г 2,5% -ной амальгамы натрия и в течение 2-3 ч перемешивают на магнитной мешалке для восстановления хинонов до фенолов. Затем раствор нейтрализуют той же кислотой до рН 1-2. Восстановленную ртуть отфильтровывают и фенолы извлекают органическими растворителями. Экстракты концентрируют и в них определяют фенольные соединения методом Арноу и методом хроматографии. В этих условиях гидролиза фенолы выявляются в виде следов.

П р и м е р 2. В отличие от примера 1 пример 2 заключается в том, что нагрев гидролизата ведется в течение 30 мин, при этом резко возрастает количество фенолов в гидролизате.

П р и м е р 3. В отличие от примера 1 пример 3 заключается в том, что нагрев раствора ведут в течение 3 ч. При этом количество фенолов в гидролизате также увеличивается, что видно из таблицы.

П р и м е р 4. В отличие от примера 1 пример 4 заключается в том, что нагрев раствора ведут в течение 6 ч. Шестичасовой гидролиз для пероксидазы хрена можно считать максимальным, так как при этом наблюдается максимальное содержание фенолов в гидролизате, что свидетельствует о равновесии реакционной системы.

П р и м е р 5. В отличие от примера 1 пример 5 заключается в том, что нагрев раствора ведут в течение 12 ч. При этом резко падает активность фермента и происходит снижение содержания фенольных соединений в гидролизате.

Результаты представлены в таблице.

Таким образом, предложенный способ позволяет расщеплять нативный комплекс фермент пероксидаза+фенолы (хиноны), при этом сокращается время проведения гидролиза, упрощается способ перевода хинонов в свободные фенолы, исключается применение серной кислоты.

Использование: изобретение относится к биохимии, может найти применение при излучении различных метаболических процессов, связанных с действием пероксидазы. Сущность изобретения: способ обработки гидролизата пероксидазы хрена, а гидролиз проводят в 1 н. HCl в течении 0,5 - 6 ч, без упаривания под вакуумом, гидролизат подщелачивают до pH 10,0 и нейтрализуют 1 н. HCl. Таким образом, предложенный способ позволяет расщеплять нативный комплекс фермент пероксидаза + фенолы (хиноны), при этом сокращается время проведения гидролиза, упрощается способ перевода хинонов в свободные фенолы. 1 табл.

СПОСОБ ОБРАБОТКИ ГИДРОЛИЗАТА ПЕРОКСИДАЗЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ФЕНОЛОВ, предусматривающий приготовление гидролизата, восстановление образовавшихся хинонов до фенолов в присутствии амальгамы натрия, нейтрализацию неорганической кислотой и экстракцию, отличающийся тем, что для приготовления гидролизата пероксидазу хрена помещают в 1 н. соляную кислоту, нагревают при 105^oC в течение 0,5 6,0 ч, полученный гидролизат подщелачивают до рН 10, а нейтрализацию проводят 1 н. соляной кислотой.