СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ Российский патент 1995 года по МПК C12Q1/04 C12N1/00 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для диагностики холеры.

Известен способ выделения холерных вибрионов путем посева исследуемого материала на плотную селективную среду, которая содержит в своей основе 2% -ный щелочный агар Хоттингера рН 8,0, сахарозу и индикатор Андреде. Однако эта среда не содержит в своей основе ингибиторов посторонней микрофлоры, поэтому выделение холерных вибрионов затруднено, особенно в загрязненных объектах.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для выделения холерных вибрионов исследуемый материал засевают на плотные щелочные питательные среды (агар Хоттингера, Мартена и др. с рН 7,8-8,0), которые содержат теллурит калия, фосфомицин, сахарозу и индикатор Андреде. После инкубирования посевов индикацию холерных вибрионов проводят по ярко-малиновой с металлическим блеском окраске колоний.

Для осуществления предлагаемого способа проводят посев исследуемого материала в объеме 0,1-0,15 мл на селективную плотную щелочную среду рН 7,8-8,0 с фосмомицином, теллуритом калия и индикаторной системой, и инкубированием посевов 18-24 ч при 36,5-37,5^оС.

При добавлении в щелочной 2-2,5%-ный агар (Хоттингера, Мартена, из сердечной мышцы рН 7,8-8,0) всех указанных ингредиентов теллурит калия 1 150000 1 200000, фосфомицин 25-30 мкг/мл, сахароза и основной фуксин, обесцвеченный 1%-ным раствором сульфата натрия, цвет и прозрачность его не меняются, морфология возбудителя остается типичной, вибрионы выделяются из малых посевных доз.

Рецепт приготовления агаровой среды: в 100,0 мл расплавленного и остуженного щелочного агара до 50-55^оС добавляют теллурит калия 1 1000 0,5 мл, фосфомицин (растворенный в 1%-ной азотной кислоте) 1 200 0,5 мл, индикаторную систему, содержащую 40%-ный раствор сахарозы 3 мл, основной раствор фуксина 0,1-0,15 мл, 1%-ный раствор сульфита натрия 5-7 мл (до обесцвечивания).

Для получения раствора теллурита калия 1 1000 (рабочее разведение) нужно взять навеску сухого препарата 1 г и развести ее в 1000 мл дистиллированной воды. Возможны другие соотношения, если необходим меньший объем 100 мг теллурита калия + 100 мл дистиллированной воды; 10 мг теллурита калия + 10 мл дистиллированной воды.

Во всех случаях получается разведение теллурита калия 1 1000 (1 мг/мл). Из этого разведения 0,5-0,67 мл добавляют в 100 мл агара, тем самым разводя рабочий раствор еще в 200 раз, получая конечную концентрацию 1 200000 1 150000 (или 5-6,7 мкг/мл), соответственно.

Для получения исходного раствора фосфомицина 100 мг сухого препарата растворяют в 20 мл 1%-ной азотной кислоты, получают рабочее разведение 5 мг/мл (или 1 200). Для получения конечной концентрации (25-30 мкг/мл) добавляют на 100 мл агара 0,5-0,6 мл из рабочего разведения.

Таким образом, состав среды следующий, мл:
Агар Хоттингера рН 100
Сахароза, 40%-ный раствор 3
Основной фуксин 0,1
Сульфит Na, 1%-ный
раствора 7-5 (до обес-
цвечивания)
Фосфомицин 1 200 (5 мг/мл) 0,5-0,6 (25-30 мг/мл или 1 40000 1 33333 конечная концентрация).

Теллурит калия 1 1000 (1 мг/мл) 0,5-0,67 (5-6,7 мкг/мл или 1 200000 1 150000 конечная концентрация).

П р и м е р 1. Посевной материал (испражнения, рвотные массы, секционный материал) в объеме 0,1-0,15 мл пересевают на плотную питательную среду рН 7,8-8,0 (агар Хоттингера, Мартена, из сердечной мышцы) с добавлением теллурита калия, фосфомицина и индикаторной системы. Посевы тщательно растирают по пластинке агара пипеткой или шпателем, инкубируют при 36,5-37,5^оС 18-24 ч, отбирают выросшие колонии, характерные для холерных вибрионов, и идентифицируют их.

На чашках наблюдается рост изолированных колоний вибрионов ярко-малиновой с металлическим блеском окраски. Посторонняя микрофлора полностью ингибируется или же растет в виде единичных изолированных колоний, которые окрашены в светло-розовые тона и не затрудняют подсчет, дифференциацию и выделение холерных вибрионов.

П р и м е р 2. Исследуемый из поверхности водоема материал засевается в тщательно подсушенную плотную щелочную питательную среду с рН 7,8-8,0 с добавлением теллурита калия, фосфомицина и индикаторной системы объемом 0,1-0,15 мл.

П р и м е р 3. При исследовании сточных вод исследование проводят по классической методике, применяя подращивание в двух пептонных водах с последующим пересевом на агаровые пластинки с добавлением теллурита калия, фосфомицина и индикаторной системы.

П р и м е р 4. Воду открытых незагрязненных водоемов перед исследованием концентрируют путем фильтрации или центрифугирования. Осадок или фильтры засевают на агаровые пластины с добавлением теллурита калия, фосфомицина и индикаторной системы. Этот вариант использования способа возможен при экспресс- и ускоренной диагностике.

Предлагаемый способ прост в использовании, требует меньших питательных сред для повторных посевов и сокращает время анализа в 2-3 раза, позволяет определить не только наличие, но и количество вибрионов в исследуемом материале, доступен для любой практической лаборатории. Применение данного способа позволяет более четко проводить обнаружение возбудителя холеры в объектах внешней среды.

Использование: для диагностики холеры. Сущность изобретения: веделение холерных вибрионов эльтор заключается в использовании твердой питательной среды для непосредственного посева исследуемого материала. Для упрощения методики и повышения чувствительности способа 2 2,5-ный щелочной агар добавляют 25 30 мкг/мл фосфомицина и теллурит калия 1 150000 1 200000 с целью ингибирования посторонней флоры, а также 40%-ный раствор сахарозы и индикатор Андреде. Учет результатов проводят по ярко-малиновой с металлическим блеском окраске колоний.

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ, включающий посев и выращивание исследуемого материала на питательной среде, содержащей щелочной агар,сахарозу и индикатор Андроде,с последующим учетом результатов по окраске колоний,отличающийся тем,что питательная среда содержит 40%-ный раствор сахарозы и дополнительно теллурит калия в конечном разведении в среде 1 150000 200000 и фосфомицин в конечной концентрации 25 30 мкг/мл среды, а учет результатов продят по ярко-малиновой с металлическим блеском окраске колоний.