ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS COAGULANS - ПРОДУЦЕНТ САЙТ - СПЕЦИФИЧЕСКОЙЙ ЭНДОКУКЛАЗЫ, СПОСОБНОЙ УЗНАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5'- CT (A/G) (T/C)AG - 3' Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-CТ(A/G)(T/C)AG-3'. Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК и физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Bacillus species M, продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5'-ACCTGC-3' и 5'-TCCGGA-3' соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-CT(A/G)(T/C)AG-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Streptococcus faecalis, продуцирующий рестриктазу Sfe I (сайт узнавания 5'-CT(A/G)(T/C)AG-3') [2]
Недостатком данного штамма является термолабильность эндонуклеазы рестрикции. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм Bacteroides distasonis, продуцирующий рестриктазу Bdi I (сайт узнавания 5'-CT(A/G)(T/C)AG-3') [3]
Однако продуцируемая этим штаммом рестриктаза является термолабильной. Для культивирования штаммов данного вида необходимы среды следующего состава, г/л: казаминовые кислоты 4, дрожжевой экстракт 3, полипептон (Difco, США) 3, глюкоза 10, NaCl 1,5, Tween-80 1, L-цистеин 0,4, вода остальное. Выращивание длится 48 ч и требует специального оборудования, так как штамм является анаэробом.

Цель изобретения получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-CT(A/G)(T/C)AG-3', не прихотливого к питательным средам и не требующего специального оборудования для выращивания.

Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus coagulansi 63 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bco163 I.

Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus coagulans163 депонирован в ВКПМ НИИ генетика под регистрационным номером В-6311, а продуцируемая им рестриктаза названа Всо163 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus coagulans163 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,8х2-12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные центрально и терминально, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 60^оС, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70^оС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, казеин, желатин; каталазоположителен; не растет при концентрации NaCl выше 5% слабый рост при 0,002% азида натрия и на среде Сабуро, наблюдали слабый рост в анаэробном агаре только при добавлении триптозного экстракта; индолотрицателен.

Для культивирования Bacillus coagulans B-6311 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят на термостатированных качалках или в ферментерах при 60^оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 1000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 3000 ед/мл.

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются:
наличие термостабильной рестриктазы;
простая питательная среда;
обычное оборудование, применяемое для культивирования аэробных бактерий.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-CT(A/G)(T/C)AG-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Всо163 I, Sfe I (5'-CT(A/G)(T/C)AG-3', Pst I, ДНК фага лямбда представляет идентичность полос расщепления при параллельном гидролизе и подтверждает их изошизомерию.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат при 60^оС. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт (Difco) 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят в ферментере при 60^оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^оС. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводят по методике Bickle, Pirotta, Imber.

П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного гидролиза субстратной ДНК с использованием в качестве маркеров длин фрагментов, полученных после гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой известной специфичности. Идентичность картин гидролиза говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов: 5'-CT(A/G)(T/C)AG-3'.

Выход фермента Всо163 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 60^оС. Выход фермента составляет 1000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 3000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
простая питательная среда;
обычное оборудование, применяемое для культивирования аэробных бактерий.

Поскольку рестриктаза Всо163 I имеет сайт узнавания 5'-CT(A/G)(T/C)AG-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Bdi I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Использование: микробиология и биотехнология. Цель изобретения выявление штамма-продуцента, обеспечивающего получение термостабильной сайт-специфической эндонуклеазы, способной узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5′-CT(A/G)(T/C)AG-3′, не требовательного к питательным средам и условиям культивирования. Сущность изобретения: предложен новый штамм Bacillus coagulans ВКПМ-В6311(163) продуцент рестриктазы Всо163 I, выделенный из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 1000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 3000 ед/мл. Рестриктаза Всо163 I является изошизомером рестриктазы Bdi I и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах.

Штамм бактерий Bacillus coagulans ВКПМ В-6311 продуцент сайт-специфической эндонуклазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-CT(A/G)(T/C)AG-3′.