ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS COAGULANS - ПРОДУЦЕНТ САЙТ - СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛАЗЫ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5′-CTCTTC-3′ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-СТСТТС-3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического каротирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Bacillus species M, продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5'-AССТGC и 5'TССGGA-3' соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестрактаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'СТСТТС-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Enterobacter aerogenes, продуцирующий рестриктазу Ear I (сайт узнавания 5'СТСТТС-3') [2]
Недостатком данного штамма является термостабильность эндонуклеазы рестрикции. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.

Наиболее близким к заявленному штамму прототипом, является штамм Kl uyvera species 632, продуцирующий рестриктазу Ksp 632I [3]
Недостатками данного штамма является то, что продуцируемая им рестриктаза является термостабильной. Выход рестриктазы не превышает 500 ед/г сырой биомассы. Для разрушения биомассы требуется специальное оборудование. Штаммы данного вида относятся к энтеробактериям, некоторые серотипы которых встречаются при массовых пищевых токсикоинфекциях, при инфекциях мочевых путей, желчного пузыря, среднего уха и мозговых оболочек.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'СТСТТС-3', с высоким выходом и активностью фермента.

Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus coagulans 116 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bco 116 I.

Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus coagulans 116 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6309, а продуцируемая им рестриктаза названа Bco 116 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus coagulans характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые 0,5-0,8 х х 2-12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные центрально и терминально, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует круглые, непигментные колонки, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 60^оС, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70^оС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, казеин, желатин; каталазоположителен; растет при концентрации NaCl до 5% слабо растет на 0,002% азиде натрия и на cреде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре, если не добавлять в среду триптон; индолотрицателен.

Для культивирования Bacillus coagulans В-6309 применяют среду следующего состава (г/л): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60^оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 8000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 10.000 ед/мл.

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента;
возможность разрушать биомассу путем ультразвуковой дезынтеграции.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-СТСТТС-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bco 116 I, Bco 116 I и Ksp 632 I (Boehringer Mannheim) Ksp 632 I фаг лямбда представляет идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 60^оС. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): пептон 10, дрожжевого экстракта (Difco) 5, глюкозы 5, воды дистиллированной остальное. Культивирование проводят при 60^оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^оС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber.

П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК. Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-СТСТТС-3'.

Выход фермента Bco 116 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДН фага лямбда в течение 1 ч при температуре 60^оС. Выход фермента составляет 8.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 10.000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента;
возможность разрушать биомассу путем ультразвуковой дезынтеграции.

Поскольку рестриктаза Bco 116 I имеет сайт узнавания 5'-СТСТТС-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Ksp 632 I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Использование: микробиология и биотехнология. Техническая задача: выявление штамма - продуцента, обеспечивающего получение термостабильной сайт-специфической эндонуклеазы, способной узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5′-CTCTTC-3′, с высоким выходом и активностью фермента. Сущность изобретения: предложен новый штамм Bacillu coalilans ВКПМ в - 6309 (116) - продуцент рестриктазы Bco 116 I, выделенный из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Выход фермента составляет 8000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10000 ед/мл. Рестриктаза Bco 116 I является изошизомером рестриктазы Bco 632 I и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах.

Штамм бактерий Bacillus coagulans ВКПМ-В-6309-продуцент сайт-специфической эндонуклазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-СТСТТС-3′.