ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECO 110 KI Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/19 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-CCTNAGG-3' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Eco110kI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером известной рестриктазы SauI и может найти применение в генно-инженерных исследованиях как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК.

Известна [1] рестриктаза SauI, которая узнает и расщепляет участок ДНК 5'-CC!TNAGG-3'. Фермент выделен из биомассы культуры Streptomyces aureofaciens IKA18/4. Содержание рестриктазы в биомассе авторами не указано. Выход очищенного фермента составляет 1000 ед на 1 г биомассы клеток.

Известна рестриктаза SshАI, являющаяся изошизомером рестриктазы SauI, выделенная из штамма Salmonella shikmonah ТК139, узнающая последовательность нуклеотидов 5'-CC! TNAGG-3' в молекуле ДНК [2] Выход очищенного фермента SshAI составляет 2400 ед/г биомассы клеток.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом, быстро растущего на обычных питательных средах.

Предлагаемый штамм Escherichia coli 110k был получен в результате целенаправленного поиска штаммов продуцентов рестриктаз среди клинических изолятов (г. Киев) при помощи разработанного нами метода тестирования активности в экстрактах, полученных из отдельно взятых колоний, выросших на агазированной среде, с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле. Содержание рестриктазы Eco110kI в предлагаемом штамме 1000000 единиц/на грамм сырой биомассы клеток.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ В-2004Д.

Штамм Escherichia coli ВКМ В-2008Д имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину, подвижные, грамотрицательные, с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясопептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть. Кроме этого, штамм может расти на синтетических средах, например М-9 (г/л: NaH₂PO₄ 6, КН₂РО₄ 3, NaCL 0,5, NH₄Cl 1, глюкоза 4, казаминовые кислоты 0,2).

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 50^оС, оптимальная температура роста 37^оС, оптимум рН 6,8-7,4. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют.

Условия хранения штамма:
Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2008Д хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при -20-70^оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.

П р и м е р 1. Тестирование ферментов рестриктазы. Для поиска рестриктаз использовали экспресс-метод, представляющий собой модификацию метода Белавина и соавт. [3] Для этого одну-две большие колонии (около 5х10⁶ 1х10⁷ клеток) суспендируют в 20 мкл буфера А (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 12,5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), содержащего 10 мг/мл лизоцима, и инкубируют при комнатной температуре (18^оС). Через 30 мин добавляют равный объем буфера В (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 2% тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), и инкубируют еще 60 мин при 4^оС. Клеточную суспензию (1 и 4 мкл) смешивают с 2 мкг ДНК фага диаметром 80 vir в 40 мкл буфера С (10 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCl). Гидролиз проводят при 37^оС в течение 10 мин. Кроме того, 4 мкл клеточной суспензии дополнительно инкубируют в 40 мкл буфера С без субстрата с целью проверки возможного наличия в растворе экстрахромосомной ДНК. Реакцию останавливают экстракцией равным объемом водонасыщенного фенола. Для электрофоретического анализа используют 20 мкл гидролизата.

П р и м е р 2. Получение и очистка рестриктазы. Культуру клеток E.coli 110k выращивают в 1 л LB-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37^оС до титра 4х10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, экстракт получают центрифугированием при 2^оС (48000). Для определения активности рестриктазы Eco110kI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgC12, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37^оС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного сферического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч. Уровень активности рестриктазы Eco110kI, определенный в бесклеточном экстракте штамма E.coli 110k, около 1000000 ед в пересчете на 1 г сырой биомассы. Рестриктаза Eco110kI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта на колонке с DEAE-целлюлозой (DE-52 Whatman) с последующей хроматографией на ДЕ-сферодексе (Pharmacia), гидроксилапатите и гепаринсефарозе (Serva). Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против буфера: 20 мМ трис-HCl, рН 7,6; 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 50% глицерин. Выход очищенного фермента составляет 20000 ед. на 1 г сырой биомассы клеток. Очищенный фермент стабилен при -20^оС в течение полугода. При +25^оС рестриктаза Eco110kI сохраняет 90% своей активности в течение 2 дней, 50% в течение 3 дней, 10% в течение 4 дней. При 0^оС рестриктаза Eco110kI сохраняет 95% своей активности в течение 2 недель. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Eco11OkI. Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводили сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность -5'-CCTNAGG-3', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах: 26718, 34319. Проведенные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза Eco110kI является изошизомером рестриктазы SauI и узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов:
5'-CCTNAGG-3'.

Кроме того, полученная рестриктаза Eco110kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции: рН для действия рестриктазы 8,4; температура действия 37^оС; KCl 25 мМ.

Таким образом, полученный штамм E.coli ВКМ В-2004Д, как продуцент специфической эндонуклеазы Eco110kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 1000000 ед на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет 20000 ед на 1 г биомассы клеток, что более чем в восемь раз превышает выход известной рестриктазы SshAI, выделенной из штамма Salmonella shikmonah ТК139, являющегося прототипом предлагаемого.

Использование: биотехнология для получения эндонуклеазы рестрикции Eco110kl, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-CCTNAGG-3′ Рестриктаза, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером рестриктазы SauI и может найти применение в генно-инженерных исследованиях. Сущность изобретения: предлагаемый штамм Escherichia coli ВКМ В-2004Д выделен из клинических изолятов (г.Киев) и обеспечивает высокий уровень содержания фермента не менее 1000000 ед/г сырого вещества биомассы клеток. Выход очищенного фермента составляет 20000 ед/г биомассы клеток.

Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2008 продуцент эндонуклеазы рестрикции Есо 110 К1.