СТОЛИК ДЛЯ ВАКУУМ-ПЕРЕНОСА И ПОДГОТОВКИ К АНАЛИЗУ ПОЛИМЕРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в генной инженерии, молекулярной биологии и генетике, в экспериментальной медицине, криминалистике.

Известен столик для вакуум-переноса полимерных соединений (например, фрагментов ДНК) из геля на мембрану. Столещница известного столика вдоль торцов снабжена бортиками. Бортики окаймляют поверхность, на которой выполнена сеть борозд. Верхняя поверхность бортиков гладкая. В центре площадки, покрытой сетью борозд, на одной из борозд, в теле столешницы выполнено сквозное отверстие, переходящее в патрубок, расположенный на стороне, противоположной поверхности с бороздами.

Перед использованием данного известного устройства подготавливаемое к анализу полимерное соединение вводят в слой геля методом электрофореза. Затем размещают гель на подстилающей его мембране. Подключают столик к вакуум-установке и осуществляют перенос введëнного в гель полимерного соединения из геля на мембрану.

Недостатками известного столика являются длительный перенос, отсутствие возможности осуществлять перенос высокомолекулярных соединений, например молекул нефрагментированной ДНК.

Техническим результатом, достигаемым при реализации предлагаемого изобретения, является обеспечение ускорения переноса полимерных соединений из геля на мембрану, обеспечение возможности переноса не только низкомолекулярных, но и высокомолекулярных полимерных соединений.

Достигается это тем, что в столике для вакуум-переноса и подготовки к анализу полимерных соединений, содержащем столешницу с сетью борозд, нанесëнной на одну из еë поверхностей, со сквозным отверстием с патрубком для отсоса воздуха, выполненными на одной из борозд, и с расположенными вдоль торцов столешницы гладкими участками-полюсами, отличительной особенностью является то, что эти участки-полюсы расположены в одной плоскости с поверхностью, покрытой бороздами, столик снабжëн крышкой, расположенной над поверхностью с сетью борозд, а отверстие для отсоса воздуха выполнено в непосредственной близости к одному из гладких участков-полос, при этом края крышки выполнены плотно примыкающими к участкам-полосам. Столик может быть снабжëн пластиной со сквозным отверстием в центре, площадь которой равна или превышает площадь столешницы, а площадь отверстия в ней равна или меньше общей площади, занятой сетью борозд. Вместо этой пластины столик может быть снабжëн набором дополнительных пластин с различной площадью отверстия в каждой из них. В столешнице может быть выполнено одно или несколько дополнительных отверстий для отсоса воздуха.

Пластина, которой снабжëн столик, может быть выполнена разборной из отдельных частей.

На фиг. 1 представлен предлагаемый столик; на фиг. 2 разрез А-А на фиг. 1; на фиг. 3 пластины на фиг. 1 с различной площадью отверстий, вариант; на фиг. 4 пластины на фиг. 1 из отдельных частей, вариант.

Столик имеет столешницу 1, на одной из сторон которой выполнена сеть борозд 2. По периметру столешницы 1 у еë торцов на этой же еë стороне оставлены полосы 3 с гладкой повеpхностью, причем поверхности этих полос 3 и площади, занятой сетью борозд 2, находятся в одной плоскости (бортики по периметру столешницы 1 отсутствуют). На площади, занятой сетью борозд 2, на одной из борозд в теле столешницы 1 выполнено сквозное отверстие 4, переходящее в патрубок 5 для подключения столика к вакуум-насосу (не показано). Таких отверстий 4 и патрубков 5 может быть несколько. Все они выполнены на площади столешницы 1, занятой сетью борозд 2, но обязательно в непосредственной близости к полосам 3 с гладкой поверхностью. Столик снабжëн пластиной 6 со сквозным отверстием 7 в центре. Пластин 6 может быть несколько (набор пластин). Они отличаются одна от другой площадью отверстия 7. Набор пластин 6 может быть заменëн разборной пластиной, состоящей из частей 8. Столик снабжëн также крышкой 9.

Столик работает следующим образом.

На столешницу 1 с той еë стороны, которая покрыта сетью борозд 2, укладывают лист Whatman ЗМ или несколько листов фильтровальной бумаги. Затем укладывают мембрану (нитроцеллюлозный, капроновый и другие фильтры), а на неë пластину из геля, в который введëн анализируемый полимер, подлежащий вакуум-переносу на мембрану. Далее укладывают пластину 6 с отверстием 7, выбрав для этого ту из них, площадь отверстия 7 в которой наиболее близка к площади пластины геля, либо используют разборную пластину, подбирая необходимую площадь отверстия 7, как показано на фиг. 4.

Поверх пластины накладывают крышку 9. Через патрубок 5 столик подключают к вакуум-насосу и в течение 15 30 мин поддерживают в устройстве вакуум на уровне от 10 до 10^-3 мм рт.ст.

После отключения вакуум-насоса устройство разбирают и известными приëмами фиксируют результаты вакуум-переноса полимера из геля на мембрану.

Ниже приведëн пример использования столика для вакуум-переноса высокомолекулярных и низкомолекулярных полимеров из геля на мембрану (показано, соответственно на нефрагментированных и фрагментированных молекулах ДНК).

П р и м е р. На слои 0,7%-ного геля из агарозы нанесли 0,5 мкг высокополимерной нефрагментированной и 1 мкг фрагментированной с помощью двух ферментов (Pst I + +Hind IП) ДНК фага лямбда, которая имеет мол. м. 50 тыс. пар нуклеотидов. Для введения полимеров в слой геля и их разделения в нëм провели электрофорез в стандартных условиях. Затем гель выдержали в растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл) и сфотографировали при ультрафиолетовом освещении. Гель выдержали по 20 мин сначала в денатурирующем растворе, содержащем 0,2 н. NaOH и 1,5 М NaCl, затем в нейтрализующем растворе 0,5 М Триса и 1,5 М NaCl. На поверхность столешницы 1, покрытой сетью борозд 2, постелили шесть листов фильтровальной бумаги, увлажнили их водой. Сверху положили мембрану капроновый фильтр (размер пор 2,5 мкм). Линейный размер фильтра должен быть на 2 5 мм больше размера слоя геля. Фильтр предварительно выдержали в воде, смочили раствором, содержащем ЗМ NaCl и 0,3 М цитрата натрия. Этим же раствором смочили уложенный поверх фильтра гель. При накладывании слоя геля на фильтр избегали образования воздушных пузырей между ними. Сверху уложили пластину 6, площадь отверстия 7 у которой несколько меньше площади слоя геля. Можно использовать сборную пластину, сформировав соответствующую площадь центрального отверстия, как показано на фиг. 2. Столик закрыли крышкой 9.

Через патрубок 5 подключили столик к форвакуумному насосу. По истечении 15 мин вакуумный насос отключили, устройство разобрали. Мембрану (капроновый фильтр) выдержали 1 мин в растворе, содержащем 0,3 М хлористого натрия и 0,03 М цитрата натрия. Затем фильтр высушивали, обрабатывали ультрафиолетом, гибридизовали известным методом с ДНК фага лямбда, меченной радиоактивным изотопом фосфора Р³² с удельной активностью 1,5 х x10⁸ имп.мин/мкг. Регистрацию результата вели радиоавтографией.

Аналогично выполняли вакуум-перенос, используя слой 0,8% -ного геля агарозы, в который вводили электрофоретически линейную ДНК обезьяньего вируса SV⁴⁰, мол. м. 5,2 тыс. пар нуклеотидов. Перенос осуществляли на нитроцеллюлозный фильтр (размер пор 0,2 мкм).

Сопоставили работу известного и нового столиков. При работе с известным столиком для получения качественной картины переноса приходилось контролировать вакуум и поддерживать его на уровне 22 30 мм рт.ст. При более глубоком вакууме наблюдалось искажение картины переноса в том месте, где слой геля находился над отверстием в столешнице. Неглубокий же вакуум не обеспечивал перенос крупных молекул полимера, например молекул нефрагментированной ДНК. Попытка углубить вакуум путëм наложения на столешницу крышки приводила к обеспечению переноса крупных молекул, однако картина переноса искажалась. Неожиданно было установлено, что перемещение сквозного отверстия в столешнице с еë центра к еë торцу устранило явление искажения картины переноса, в том числе и при глубоком вакууме от 10 до 10^-3 мм рт.ст. с наложением крышки на столешницу. При этом был обеспечëн перенос и крупных молекул, например молекул нефрагментированной ДНК (фиг. 4), причëм процесс переноса ускорился.

Описанные закономерности повторялись и при выполнении в столешнице нескольких сквозных отверстий.

Кроме того, на столешнице столика выполнены бортики вдоль еë торцов. Однако было замечено, что при выполнении бортиков на столешнице нового столика, наложении на неë крышки и подключении вакуума от 10 до 10^-3 мм рт.ст. создаются условия разрежения не только под, но и над слоем геля. Это также приводит к искажению картины переноса. Выполнение же по периметру столешницы полос с гладкой поверхностью в одной плоскости с поверхностью, занятой сетью борозд (т.е. при оставлении этих полос на плоской столешнице без бортиков), уменьшает искажение картины переноса. Искажение полностью устраняется, если после укладки слоя геля сверху накладывается пластина со сквозным отверстием в центре, равным по площади слою геля.

Таким образом, новое устройство позволило ускорить процесс вакуум-переноса полимерных соединений из слоя геля на мембрану, получить при этом качественную картину, причëм осуществлять перенос не только низкомолекулярных полимеров (например, фрагментов ДНК), но и высокомолекулярных полимеров (например, нефрагментированной ДНК).

Использование: относится к биотехнологии и может найти применение в генной инженерии, молекулярной биологии и генетике. Сущность изобретения: столик для вакуум-переноса полимерных соединений из геля на мембрану содержит столешницу, на одной из поверхностей которой выполнена сеть борозд с оставлением полос гладкой поверхности вдоль торцов. В теле столешницы на площади, занятой бороздами, на одной из них выполнено сквозное отверстие, переходящее в патрубок, который расположен на стороне, противоположной поверхности с бороздами. При этом полосы с гладкой поверхностью находятся в одной плоскости с поверхностью, покрытой бороздами. Столик дополнительно снабжен крышкой и пластиной со сквозным отверстием в центре. Отверстие в столешнице выполнено в непосредственной близости к одной из полос с гладкой поверхностью. Края крышки выполнены с возможностью их плотного примыкания к гладким поверхностям столешницы, а площадь выполненного в ней отверстия равна или меньше столешницы, занятой сетью борозд. В теле столешницы может быть выполнено несколько сквозных отверстий, каждое из которых переходит в патрубок. Столик может быть снабжен набором пластин, различающихся площадью отверстия. Пластина может быть выполнена разборной. 4 з. п. ф-лы, 4 ил.

1. СТОЛИК ДЛЯ ВАКУУМ-ПЕРЕНОСА И ПОДГОТОВКИ К АНАЛИЗУ ПОЛИМЕРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ, преимущественно биологических полимеров, содержащий столешницу с сетью борозд, нанесенной на одну из ее поверхностей, со сквозным отверстием и с патрубком для отсоса воздуха, выполненным на одной из борозд, и с расположенными вдоль торцов столешницы гладкими участками-полосами, отличающийся тем, что гладкие участки-полосы расположены в одной плоскости с поверхностью, покрытой бороздами, столик снабжен крышкой, расположенной над поверхностью с сетью борозд, а отверстие для отсоса воздуха расположено в непосредственной близости к одному из гладких участков-полос, при этом края крышки выполнены плотно примыкающими к участкам-полосам. 2. Столик по п.1, отличающийся тем, что он снабжен пластиной со сквозным отверстием в центре, площадь которой равна или превышает площадь столешницы, а площадь отверстия в ней равна или меньше общей площади, занятой сетью борозд. 3. Столик по п.1, отличающийся тем, что он снабжен набором дополнительных пластин с различной площадью отверстия в каждой из них. 4. Столик по п.1, отличающийся тем, что в столешнице выполнено одно или несколько дополнительных отверстий для отсоса воздуха. 5. Столик по п.1, отличающийся тем, что пластина выполнена разборной из отдельных частей.