Способ конструирования рекомбинатной плазмидной ДНК и штамм продуцент эндонуклеазы рестрикции Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 

1 Изобретение относится к микроби логической промьшшенности и генети ческой инженерии. Фермент R, EcoRV используют в нетической инженерии, как в экспер ментах по конструированию рекомбинантных ДНК, так и при изучении пе вичной структуры ДНК. Известен способ конструирования рекомбинатной плазмидной ДНК, который основан на обработке двух плазмид эндонуклеазами рестрикции, лигировании .с помощью ДНК-лигазы фага Т, трансформации клеток Е. coll смесью образующихся фрагме тов плазмид, отборе среди трансфор мантов, устойчивых к ампициллину клонов, обеспечивающих рестрикцию и модификацию фага с последующим вьщелением соответствующей пла шадной ДНК Cl Известна плазмидная ДНК, кодирующая синтез эндонуклеазы рестрикции R. EcoRV, известен соответствующий штамм Е. coli - продуцент R. EcoRV и спосдб получения указанного фермента. Недостатком известной рекомбинатной ДНК является относительно низкий уровень синтеза фермента, относительная нестабильность реком бинантной ДНК pILRV л в клетках бактерий, что ограничивает возможность ее использования в промьшленньк условиях. Целью изобретения является способ конструирования рекомбинатной плазмидной ДНК pILRVS, а также получение штамма-продуцента EcoRV и увеличение выхода целевого продукта-фермента эндонуклеазы рестри ции EcoRV. Для достижения цели в способе конструирования рекомбинатной плаз мидной ДНК pILRVS5 заключающемся в том, что среди клонов Escherichia cosi ВШ В-145ПД с плазмиднойДНК pILRV отбирают клоны, содержащие укороченную на 500-600 пар оснований плазмидную ДНК pILRVJ л , обладающую генами рестрикции и модифи кации EcoRV и имеющую уникальный сайт эндонуклеазы рестрикции Bg .затем вьщеленную плазмидную ДНК pILRV7.д.и ДНК фага Л с 1 875 обр батывают эндонуклеазой рестрикции BR К II, образующиеся,фрагменты сши вают ДНК-лигазой фага Т4, получен смесью рекомбинантных молекул ДНК 9 ( . -2 трансформируют клетки Escherichia coli JC 5183 и цз клонов, устойчивых к ампициллину и обладающих иммунитетом к фагу вьщеляют целевую рекомбинатную плазмидную ДНК. Для получения штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli ВКМ В-1455Д (Всесоюзная Коллекция Микроорганизмов при -Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР) - продуцент зндонуклеазы рестрикции EcoRV. Пример 1. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК pILRVS состоит из двух этапов. На первом этапе проводят поиск стабильных вариантов плазмидной рекомбинантной ДНК pILV7. Для этого штамм Escherichia coli БКМ В-1450Д, содержащий плазмиду pILRV7, подращивают в LB бульоне в течение 15 ч, после чего высевают на селективную агаризованную среду с ампициллином (LB - бульон содержит 10 г бакто- ; триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCI рН 7,4 на 1 л воды). Среди выросших клонов отбирают клон клеток, содержащий стабильную плазмиду,названную pILRV7 и сохранивший фе-« нотипические признаки -штамма E.coli ВКМ В-1450Д. Из клеток этого клона вьщеляют плазмидную ДНК по методу (Clewell and Helinsky) 1969, PNAS 62, 1159-71166). Рестрикцио нньй анализ вьделенной плазмиды pILRV7 проводят, с помощью эндонуклеаз P:jtI,Bgtil,.coiiL . На втором этапе в полученную плазмиду PILRV74 вводят областьиммуни- , тета фага Л с промотором ранних генов Рг и термочувствительным репрессором. Дпя этого вьщеляют ДНК фага 1( с 1857 по методу (A.D. Kaiser, Hognes D.S. 1960, j. Mol Biol 392-415). 1 МКГ ДНК плазмиды pILRV7 и . 4 МКГ ДНК фага Д с 1 857 инкубируют в буфере А (20 мМ Трис-НС рН 7,6, 10 мМ MgC2, ,10 мМ дитиотреитола) с эндонуклеазной рестрикции Bgt II. Гидролиз проводят в течение часа при , после чего гидролизат проверяют электрофорезом в 0,9% агарозе в ацетатном буфере. Фрагменты ДНК фага с 1857 (2 мкг) смешивают с линейной ДНК плазмиды р1LRV7 Л (0,2 мкг), добавляют дитиотреитол и АТФ до конечной концентрации 10 мМ и 100 мкМ соответственно. и 5 ед. лигазы фага Т,. Общий объем лигируемой смеси - 30 мкл. Лигирование проводят в течение 1 ч при , после чего добавляют 210 мкл НлО, дитиотреитол и АТФ до конечной концентрации 10 мМ и 100 мкМ соответственно, а также 10 ед. лигазы. Общий объем лигируемой реакционной смеси доводят до 300 мкл. Лигирование продолжают при 12°С 48 ч. Через шестнадцатичасовые интервалы отбирают аликвоту (100 мкл) и трансформируют Са -клети Е. coli JC 5183. Получение компетентных клеток и трансформацию проводят по методу (Cohen A.N.a.c. Y Chang 1972, PNAS USA 69: 2110-2114). Трансформанты высевают на селективную среду с ампициллином (30 мкг/мл), предварительно проинку бировав 10 мин с фагом с 126 из расчета 10 фаговых частиц на чашк Выросшие трансформанты проверяют на наличие иммунитета к фагу Л с 1 857. Для этого сравнивают эффективность посевов фага А с 1 857 и фага Л (imm) 21 на клетках Е. coil ЗС 5183, а также на клетках этого же штамма, не. содержащих рекомби нантных ДНК. Из отобранных трансформанты вьщеляют рекомбинантную плазмидную ДНК P3LRV8 методом (Klein D.L. Schlesing Е, Wello R.D. 1980 Plasmid 3,88-93). Полученную ДНК. анализируют с помощью рестриктаз Bge II, Pst I, Hind III. Ha основе данных рестрикционного анализа построена схема рекомбинатной плазмидной ДНК P3LRva. Полученная рекомбинантная плаз- мидная ДНК содержит гены системы рестрикции-модификации EcoRV, ген бета-лактамазы, определяющий резистентность клеток к ампи циллину, область иммунитета фага с термочувствительным репрессором с1, ген rex, а также промотор ранних генов Рг. Рекомбинантная - плазмидная ДНК pJLRVB состоит из плазмидной ДНК p3L RVTA; расщепленной по Eg г И-сайту (размер ДНК плазмиды 5.8 т.п.о.) и Bg8 II-фрагмента ДНК фага Л CI 857 с размером 2.4 т.п.о. Общий размер рекомбинантной плазмидной ДНК piLRVS равен 8.2 т.п.о. Б ДНК плазмиды имеются два сайта эндонуклеазы Bg I II 9 по три сайта эндонуклеаз Hind III и Pst I. Пример 2. Для получения штамма-продуцента эндонуклеазы рестрикции EcoRV рекомбинантную плазмидную ДНК pILRV8 трансформируют в штамм Е. coli ЗС 5183. Клетки штамма Е. coli JC 5183 подращивают до титра кл/мл, после чего осаждают при 6000 g 15 мин при температуре 0°С. Клетки суспендируют в равном объеме 0,1 М раствора хлористого кальция и выдерживают при 1 ч, после чего повторно осаждают при 6000 g, и ресуспендируют в 0,1 М раствора хлористого кальция. К 50 мкл ДНК, полученной после .обработки ДНК лигазой фага Т, добавляют 100 мкл компетентных клеток. Смесь выдерживают 20 мин при 0°С, затем 2 мин при и 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1,3 мл среды LB, инкубируют 2ч при 37°С с аэрацией. Суспензию высевают на чашки с твердой средой, содержащей ампициллин (30 мкг/мл). Трансформанты отбирают по методу, описанному в примере 1. Сконструированньш щтамм E.coll ВКМ В-1455 Д и штамм Е. coli БКМ В-1450 Д проверяют на продук- цию рестриктазы EcoRV. Для этого обе культзфы подращивают в 1 л среды LB до титра 5-10 клеток 1 мл при. 30°С и 37 °С. Клетки осаждают центрифугированием при 6000 g 15 мин., после чего по 0,9 г (сырой вес) биомассы каядого штамма суспендируют в 6 мп буфера 50 мМ трис-НСЕ, рН 7,6, 0,2 М NaCI, 3мМ-меркап:тоэтанола, 100 мкг/мл лизоцима и вьщерживают 40 мин при . Клетки разрушают ультразвуком. Полученный экстракт центрифугируют при 48000 g, 2°С. Супернатант используют для определения активности фермента. С этой целью делают серийные разведения Э1 стракта: 1/100, Т/500, 1/1000, 1/5000, 1/25.000, 1/50000. По 1 мкл каждого разведения инкубируют 1 ч -при 37°С с 1 мкг .ДНК фата Л в 30 .мкл инкубационной смеси с 50 мМ трис-НСе рН 7,6, 50,мМ NaCe, 10 мМ Mg С ,, 6 мМ р-мер каптоэтанолом. Уровень активности фермента зн онуклеазы рестрикции Е. coli RV

510741396

в бесклеточном экстракте сконструи- тавляет в пересчете на 1 г биомассы рованного E.coli ВКМ В-1455 Д при вы (сьфой вес) более чем 15.000.000 ед. ращивании при более чем в 5 раз активности фермента EcoRV. При выше уровня активности этого же фер- уровни активности фермента в мента в штамме ВКМ В-1Д50 Д и сое- 5 обоих штаммах одинаковы.

1. Способ конструирования рекомбинантной гшазмидной ДНК pIL RV8, заключающийся в том, что среди клонов Escherichia coli ВКМ В-1450 Д с плазмидной ДНК PILRV7 отбирают клоны, содержащие укороченную на 500-600 пар оснований плазмидную ДНК pILRV7 Л , обладающую генами рестрикции и модификации Есо -RV и имеющую уникальный сайт эндонуклеазы рестрикции , затем вьщеленную плазмидную ДНК PILRV7 а к ДНК Фага с 1 875 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Bg II, образукициеся фрагменты сшивают ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью рекомбинантных молекул ДНК трансформируют клетки Escherichia coll JC 5183 и из клонов, устойчивых к ампициллину и обладающих иммунитев том к фагу X вьделяют целевую рекомбинантную плазмидную ДНК. . 2. Штамм Escherichia coli ВКМ В -1455 Д (Всесоюзная коллекция Микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) 8 е продуцент эндонуклеазы рестрикили ECORV. 4; СО ;о