ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES - ДЕСТРУКТОР ОКСИЭТИЛИРОВАННЫХ СПИРТОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Изобретение относится к области микробиологической промышленности и заключается в получении нового штамма бактерий. Оксиэтилированные спирты (ОЭС) один из наиболее распространенных классов неионогенных поверхностно-активных веществ, широко применяемый в промышленности и в быту. ОЭС представляют собой эфиры жирных спиртов и полиэтиленгликолей.

Известны аналогичные штаммы микроорганизмов, способные их утилизировать. Например, штамм Pseudomonas mendocina 2S (1) утилизирует смесь трех поверхностно-активных веществ и среди них ОЭС синтанол ДС-10 в концентрации 500 мг/л на 98% за 48 ч. Штамм Pseudomonas fluorescens 5/7 утилизируют за 24 ч синтанол ДС-10 в концентрации 0,5 г/л на 60% В обоих случаях используемый колориметрический метод определения свидетельствует о разрушении оксиэтильной части молекулы; данные о разрушении углеводородной части молекулы и о наличии или отсутствии свободных полиэтиленгликолей (ПЭГ) основного метаболита при разрушении ОЭС отсутствуют.

Наиболее близким к заявленному штамму является штамм Pseudomonas mendocina (2), утилизирующий ОЭС синтанол АЛМ 10 в концентрации 3000 мг/л на 70% за 30 ч. При этом разрушается лишь углеводородная часть молекулы синтанола. Количество свободных полиэтиленгликолей, образовавшихся вследствие неполной деструкции оксиэтильной части молекулы синтанола, достигает концентрации 1200 мг/л.

Целью изобретения является выделение штамма с высокой деструкционной активностью по отношению к ОЭС, разрушающего как углеводородную, так и оксиэтильные части молекулы.

Предлагаемый штамм Preudomonas species ОС-22 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-6563 и характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки. В мазках мелкие грамотрицательные палочки, расположенные поодиночке или короткими цепочками. Спор и капсул не образуют, подвижные.

Культуральные свойства. Прототроф, аэроб. Растет на простых питательных средах.

Рост на стандартных твердых средах. На среде общего назначения для всех сапрофитных бактерий мясо-пептонном агаре (МПА) наблюдался хороший рост, в первые сутки вырастали колонии диаметром 1-1,5 мм, на вторые сутки диаметр колоний увеличивался до 2-3 мм. На среде Эшби, используемой для выявления азотфиксаторов, и среде Чапека для выявления микроорганизмов, использующих минеральные формы азота, рост отсутствовал.

Среды имеют следующий состав (г/л дистиллированной воды):
МПА
панкреатический гидролизат кильки 25,0; NaCl 5,0; K₂HPO₄ 1,0; крахмал 0,5; агар 20,0;
среда Эшби
сахароза 20,0; K₂HPO₄ 0,2; MgSO₄ 0,2; NaCl 0,2; K₂SO₄ 0,1; CaCO₃ 5,0; агар 20,0;
среда Чапека
сахароза 20,0; NaNO₃ 2,0; KH₂PO₄ 1,0; MgSO₄ 0,5; KCl 0,5; CaCO₃ 3,0; агар 20,0.

Рост штамма наблюдали при температуре 20 35^o. Оптимум роста - 28-30^oC, при 42^oC рост отсутствует. Штамм растет в широком диапазоне pH: min 5, max 9,5. Оптимальный рост при pH 7,0-7,6. На мясо-пептонном агаре после 48 ч роста образует мелкие колонии округлой формы, блестящие, выпуклые, бесцветные, консистенция маслообразная, край ровный; диаметр колоний 2-3 мм. Рост на косом агаре хороший по штриху; при посеве уколом в столбик - интенсивный на поверхности. Рост на мясо-пептонном бульоне обильный с пленкой на поверхности.

Физиолого-биохимические свойства. Оксидазоположителен. Продуцирует каталазу, аргинингидролазу. Не образует уреазу, лецитиназу, желатиназу, орнитиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, нитратредуктазу, индол, сероводород. Растет на средах с глюкозой, арабинозой, ксилозой. На OF-среде с глюкозой и ксилозой наблюдается кислотообразование; с рамнозой, арабинозой, мальтозой и сахарозой кислотообразования не наблюдается. Утилизирует цитрат на среде Симонса. Не растет в присутствии 6,5% NaCl, отсутствует рост на безазотистой среде Эшби и среде Чапека. Не гидролизует крахмал. Не образует пиоцианин и флуоресцирующие пигменты на средах Кинг А и Кинг В. Растет на среде Плоскирева. Не вызывает гемолиз эритроцитов.

Отношение штамма к источникам азота: использует для питания органическую и аммонийную формы азота, не использует нитратную и нитритную формы и газообразный азот.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Штамм устойчив к пенициллину, оксациллину, ампициллину, карбенициллину, эритромицину, олеандомицину, линкомицину, ристомицину, фузидину, левомицетину, полимиксину; штамм чувствителен к тетрациклину, стрептомицину, мономицину, гентамицину, неомицину, канамицину, доксициклину.

Условия хранения. Штамм хранят на столиках с полужидким 0,06% агаром под слоем стерильного вазелинового масла при 4^oC.

Патогенные свойства. При внутрибрюшинном заражении беспородных белых мышей (10 животных) взвесью суточной культуры штамма в количестве 1 млрд. микробных тел в 0,5 мл физиологического раствора на животное заболевание не обнаружено. Срок наблюдения 10 дней. Это дало основание считать культуру штамма непатогенной.

На основании комплекса морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств штамм был идентифицирован как Pseudomonas species.

Пример 1. Получение штамма.

Микроорганизм-деструктор ОЭС выделен методом накопительной культуры из содержащих ОЭС сточных вод металлообрабатывающего предприятия. Материал в количестве 20 мл вносят в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую 100 мл синтетической минеральной среды следующего состава (г/л): Na₂HPO₄-6,0; KH₂PO₄-3,0; NaCl-0,5; NH₄Cl-1,0; pH 7,2. В среду добавляют синтанол ДС-10 в концентрации 0,5 г/л. Концентрацию синтанола в среде в процессе культивирования поддерживают на уровне 0,5 г/л отливно-доливным методом. Культивирование проводят на качалке при 160 об/мин и t 28^oC. Через 5, 10 и 15 сут. из накопительной культуры отбирают пробы, которые высевают на агаризованную синтетическую среду того же состава. Одновременно пробы анализируют на присутствие синтанола и выделяют чистые культуры бактерий. Деструктивную активность выделенных культур опять проверяют в жидкой синтетической среде. Количественное определение ОЭС проводят колориметрическим методом с фосфорно-молибденовой кислотой.

Культуру отсевают на столбик с полужидким агаром и хранят под слоем вазелинового масла при 4^oC. Идентификацию проводят общепринятым способом.

Пример 2. Деструкция оксиэтилированных спиртов при периодическом культивировании.

Культивирование проводят в жидкой минеральной среде вышеуказанного состава. ОЭС добавляют в концентрации 500-1000 мг/л, исходная концентрация клеток составляет 5•10⁸ кл/мл. Инкубируют при 28^oC на качалке при 160 об/мин. Контроль осуществляют общепринятым колориметрическим методом с фосфорномолибденовой кислотой.

Результаты представлены в таблице.

Пример 3. Деструкция синтанола ДС-10 штаммом Pseudomonas species ОС-22 при непрерывном культивировании.

Непрерывное культивирование в лабораторных условиях осуществляют в модельном растворе, представляющем собой жидкую минеральную среду с добавлением синтанола в концентрации 500 мг/л. Процесс проводят в биореакторе в условиях проточного культивирования. Аэрацию осуществляют компрессором при подаче воздуха 1 л на литр среды за минуту, t составляет 25^oC. Модельный раствор подают в биореактор со скоростью 0,04 ч^-1. Для заселения биореактора культурой штамма-деструктора последнюю выращивают на мясо-пептонном агаре и полученную биомассу иммобилизуют на носителе в установке. Очищенная вода содержит синтанол в концентрации 5-10 мг/л. Эффективность очистки составляет, таким образом, 98-99% (по данным калориметрического анализа).

Пример 4. Анализ разрушения структурных компонентов молекулы ОЭС штаммом ОС-22.

В качестве тест-субстрата используют синтанол ДС-10. Культивирование проводят в жидкой минеральной среде с добавлением синтанола в концентрации 500 мг/л. Периодическое культивирование проводят в условиях, описанных в примере 2, непрерывное культивирование в биореакторе, как описано в примере 3.

Разрушение вещества исследуют методом ИК-спектроскопии. По данным этого метода при периодическом культивировании разрушение вещества составляет 92% при непрерывном 98% причем деструкции подвергаются как углеводородная, так и оксиэтильная часть молекулы синтанола. Не происходит накопление свободных полиэтиленгликолей, основного метаболита ОЭС, т.к. они тоже утилизируются предлагаемым штаммом.

Таким образом, предлагаемый штамм разрушает оксиэтилированные спирты в концентрации 500-1000 мг/л на 76-98% разрушая при этом как углеводородную, так и полиэтиленгликолевую части молекулы.

Использование: изобретение относится к микробиологии. Сущность изобретения: предложен штамм бактерий Pseudomonas species ВКПМ В-6563, утилизирующий эфиры жирных спиртов и полиэтиленгликолей, которые широко применяются в промышленности и быту и являются наиболее распространенными загрязнителями окружающей среды. Предлагаемый штамм разрушает оксиэтилированные спирты в концентрации 500-1000 мг/л на 76-98%, при этом деструкции подвергаются как углеводородная, так и полиэтиленгликолевая часть молекулы. 1 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas species ВКПМ В-6563 деструктор оксиэтилированных спиртов.