Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUScULUS L - продуцент моноклональных антител к миоглобину человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

щие клоны выделяют по результатам пятен- ного иммуноферментного анализа (ИФА) и радиоиммуноанализа (РИА) и обозначают 8D6.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Культура штамма состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток примерно одинаковой величины с крупными ядрами.

Культуральные признаки.

Среда для культивирования - 1М или DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере 4-6% С02. Посевная доза 0,2-106 кл/мл, клетки пассируют 1 раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:5 (из плотности 106 кл/мл). Культура полусуспензионная, выращивается в пластиковых культуральных флаконах. Штамм продуцирует антитела на протяжении как минимум 50 пассажей в культуре.

Для выращивания штамма в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей линии BALB/c в количестве 10 кл/на мышь; за 10-15 дней до прививания клеток мышь сенсибилизируют введением 0,5 мл пристана внутрибрюшинно. Асцит образуется через 10-15 дней. Асцитную жидкость забирают 2-5 раз через 1-2 дня. Общий выход асцитной жидкости 10-15 мл/нз мышь. Штамм перевивается с эффективностью не менее 80%.

Продуктивность штамма. Титр антител в культуральной жидкости сохраняется неизменным на протяжении 50 клеточных генераций. Титр антител в асцитной жидкости сохраняется неизменным на протяжении 4-х пассажей.

Характеристика полезного продукта. Штамм синтезирует мои AT класса lgG1. Константа диссоциации иммунного комплекса составляет 6.25-10 9 М. МонАТ сохраняют способность к связыванию с Мч после модификации их хелатными соединениями редкоземельных металлов.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, контроль на контаминацию вирусами и микоплазмами не проводился.

Криоконсервирование. Клетки замораживают на криопротекторной среде, содержащей, %: 1М DMEM 60; эмбриональная телячья сыворотка 7; сыворотка крупного рогатого скота 23; диметилсульфоксид 10. Ампулы помещают в пенополистирольную закрытую коробку толщиной стенок 1 см, оставляют при -70°С на 20 ч, затем переносят в жидкий азот. Размораживают клетки в термостате при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70%.

П р и м е р 1. Получение штамма

гибридных культивируемых клеток мыши Mus.Musculus, продуцирующего монАТ к Мч,

Мышам линии BAL В/с вводят 100 мкл

0 раствора Мч в концентрации 0.5 мг/мл в 100 мкл полного адьюванта Фрейнда. С интервалом в 3 недели проводят еще 2 инъекции в неполном адъюванте Фрейнда. За 4 дня до гибридизации вводят 100 мкг Мч в 200

5 мкл физиологического раствора внутривенно; В следующие 2 дня повторяют инъекции внутрибрюшинно. Клетки селезенки иммунизированной таким образом мыши ( 10 клеток ) объединяют с клетками миело0 мы мыши Х63-Ад 8.653 (5-Ю7 клеток) в при- . сутствии 1 мл 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол м. 1000. После добавления ПЭГ реакционную смесь центрифугируют 3 мин, 200 д, супернатант сливают, клетки ресуспенди5 руют в 6 мл среды 1М, содержащей 10% ЭТС, гипоксантина, М ами- ноптерина и 1, М тимидина. Гибрид- продуцент отбирают с помощью пятенного ИФА супернатантов культур. Для этого на

0 нитроцеллюлозные фильтры (диаметр пор 0,45 мкм) размером 4x4 мм с помощью микрошприца наносят 10 нг очищенного Мч в объеме 0,1 мкл. Для уменьшения неспецифического связывания фильтры инкубиру5 ют в растворе 0,02% желатина в буфере TBS (0,02 М трис-HCI, рН 7,5, 0,15 М NaCI). Обработанные таким образом фильтры разносят по лункам 96-ячеечного планшета и инкубируют в течение 4 ч при комнатной

0 температуре с 50 мкл супернатантов культуральной среды в разведениях от 1:10 до 1:105. После инкубации фильтры отмывают 3 раза в ТВЗ и вносят по 50 мкл конъюгата антител козы против IgG мыши с пероксида5 зой хрена. После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре фильтры отмывают 3 раза вТВЗ и связавшуюся перок- сидазу и антитела против Мч детектируют по расщеплению субстрата (Н202) в присут0 ствии хромогена 4-хлор-1-нафтола. Наличие антител определяют по степени антенсив- ности окрашивания пятен фиолетового цвета. Для дальнейшей работы отбирают только высокопродуктивные и специфичные

5 клоны по наиболее интенсивно окрашенным пятнам.

П р и м е р 2. Анализ неперекрываемости эпитопов связывания монАТ штамма4D4 с Мч. Клетки штамма помещают в пластиковые флаконы с площадью дна 75 см2 в количестве 3-10 в 20 мл среды Ш с 10% ЭТС, 100 мкг/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют 3-4 дня при 37°С в атмосфере 5% С02. Культураль- ную среду вместе с клетками собирают, центрифугируют 10 мин при 800д, клетки отмывают один раз средой Ш без сыворотки и вводят в количестве 107 кл/мл внутри- брюшинно мышам линии BAL В/с, сенсибилизированным за 7-10 дней приста- ном. Из полученных асцитных жидкостей выделяют монАТ осаждением насыщенным раствором сульфата аммония (1 ч при 4°С). После центрифугирования (30 мин, 2000д, 0°С) осадок диализуют против буфера 0.025 М Na-фосфат, рН-7,5. 0,15 М NaCI, 0,05% МаМОз в течение 2 сут, затем проводят гель- фильтрацию на колонке с сефакрилом S- 300 (объем колонки 500 мл), буфер элюции 0.0125 М Na-фосфат, рН 8,4. 0,15 М NaCI, 0,05% NaNOa. Выход пика иммуноглобулина контролируют по оптической плотности, степень очистки определяют по электрофорезу в полиакриламидном геле.

Очищенные монАТ клона 4D4 сорбируют на поверхности полистирольных пробирок из раствора с концентрацией 0,2 мг/мл в 0,01 М трис/HCI, рН 7.5, 0.1 М NaCI. В каждую пробирку наливают 400 мкл раствора монАТ и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, остаточные центры сорбции блокируют 0,01 Мтрис/HCI, рН7,7. 0,14 М NaCI, 10% бычья сыворотка, 0,02% твин-20,0.05% NaNOs. Для определения пе- рекрываемости эпитопов связывания мо- нАТ в -пробирки в иммобилизованными актителами клона 4D4 вносят Мч, меченый

л ПС

I (36,5 мкг Мч на пробу) и антитела того же штамма в разных концентрациях. Все растворы монАТ готовят на буфере, в котором проводят блокировку. После добавления монАТ пробирки инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем жидкую фазу оттягивают, а количество связанного Мч определяют по излучению 1251 на счетчике, время счета 1 мин.

Проведенный опыт показывает, что при внесении антител штамма 4D4 наблюдается уменьшение связывания Мч с монАТ, иммобилизованными на пробирке. Это свидетельствует о том, что монАТ, продуцируемые штаммом 4D4, взаимодействуют с двумя неперекрывающимися эпи- топами молекулы Мч.

ПримерЗ. Использование монАТ штамма 4D4 в двухсайтном флуороиммуно- метрическом анализе на Мч.

МонАТ очищают из асцитных жидкостей, как описано в примере 2, сорбируют

на полистирольных пробирках. В качестве проявляющих антител используют монАТ штамма 8D6, предварительно меченных Еи следующим образом. 2,5 мг очищеннных монАТ штамма 8D6 растворяют в 0,5 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера, рН 9,0 и добавляют изотиоцианатофенипкомплексонатевропия (150-кратный молярный избыток), инкубируют 12-18 ч при 4°С. От несвязавшегося

0 реагента освобождаются гель-фильтрацией на колонке с ультрагелем АсА34, размеры колонки: 1x27 см. буфер элюции 0.05 М трис-HCI, 0,15 М NaCS, 0.05% NaNOs, pH 7,5 (TBS). В пробирки с иммобилизованными

5 монАТ штамма 4D4 вносят по 1 мкг мечек- кых Ей монАТ иламма 8D6 в 350 мкл TBS, содержащею 0,02% твин-20 и 10% бычьей сыворотки. Затем с интервалом 15с вносят по 50 мкл разведений сывороток или соот0 ветствующих стандартов Мч. После инкубирования в течение 15 мин при комнатной температуре жидкую фазу отсасывают при помощи водоструйного насоса и добавляют в каждую пробирку по 400 мкл TBS, со5 держащего 0,02% твин-20 для отмывки. Процедуру отмывки повторяют 3 раза, в отмытые пробирки добавляют по 400 мкл усиливающего раствора, выдерживают по 10 мин на встряхивателе и измеряют интен0 сивность флуоресценции на время-разре- шенном флуориметре.

Результаты анализа показывают, что даже при значительном разведении контрольной сыворотки (в 256 раз) получают

5 достоверный сигнал. Это свидетельствует о том, что метод двухсайтной время-разре- шенной флуороиммунометрии позволяет определять уровень Мч в диапазоне концентраций от 2 до 1000 нг/мл. Аналогичный

0 метод с использованием радионуклида 1251 характеризуется меньшей чувствительностью - минимальная концентрация Мч в пробе 10-15 нг/мл. Кроме высокой чувствительности, следует отметить быстроту мето5 да 30 мин (в случае РИА около 1 ч), что крайне важно для экспресс-диагностики инфаркта миокарда.

Таким образом штамм 4D4, продуцирующий монАТ к Мч, может быть использован0 в двухсайтном флуороиммунометрическом анализе и обеспечиваетповышение чувствительности метода в 5 раз по сравнению с известными методами и сокращение времени анализа до 30 мин.

5

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.MuscuIus L. ВСКК(П) № 221Д - продуцент моноклональных антител к миоглобину человека

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для количественного определения миоглобина человека в сыворотке крови. Целью изобретения является получение штамма гибридныхклеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к непеИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для количе- ственного определения миоглобина человека в сыворотке крови. Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к неперекрещивающимся эпитопам миоглобина человека. Штамм МГ,806.А2.Р7 (далее обозначается 8D6)хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под № ВСКК(П)221Д. рекрещивающимся эпитопам миоглобина человека. Штамгч получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALB/c клетками миеломы Х63-Ад.8.653. Штамм получил название 8D6 и/ депонирован под номером ВСКК(П) № 221Д, Клетки штамма культивируют на среде 1 М с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки монАТ, продуцируемые штаммом 8D6, относятся к кляссу igG1. имеют константу связывания 6,25x10 М и направлены против неперекрывающихся эпитопов молекулы миоглобина. Культуральные свойства штамма ипичны для гибридом, продуктивность в титрах антител 10 в культуральной жидкости и 10 в асцитической. МонАТ не теряют способности к связыванию с миогло- бином после модификации их хелатными соединениями редкоземельных металлов, что дает возможность использовать их в двух- сайтных флуороиммунометрических систе- мемах анализа. Чувствительность такого анализа составляет 2 нг миоглобина на 1 мл раствора. Штамм получают следующим образом. Мышей линии BAL В/с иммунизируют раствором очищенного Мч. Первые иньек-1 ции Мч проводят в сочетании с полным и неполным адъювантом Фрейнда, заканчивают иммунизацию инъекциями Мч в физиологическом растворе. Слияние иммунных спленоцитов с клетками плазмоцитомы P3.X63-Ag8.653 проводят в присутствии 40% полиэтиленгликоля (мол. м. 1000). Для отбора гибридных клеток в ростовую среду 1М добавляют гипоксантина, аминоптерина, 1,6-10 М тимидина. Наиболее продуктивные знтителопродуцируюО 00 Ю со 00 Ю