Изобретение касается ферментного способа энантиоселективного получения оптически активных циангидринов из альдегида или несимметричного кетона и донора циангруппы при воздействии оксинитриллиазы.
Циангидрины являются ценными продуктами для синтеза альфа-оксикислот, которые используются при получении биологически активных веществ, например, фармацевтических активных веществ, витаминов, а также пиретроидных соединений.
В J.Am.Chem. Soc. 1991, 113, 6992-6996 описан способ получения R-циангидринов реакцией обмена ароматических или алифатических альдегидов с ацетонциангидрином в присутствии D-оксинитрилазы. Чтобы получить обращенный энантиомерами продукт, процесс необходимо проводить в присутствии органического, не смешивающегося с водой растворителя, так как один водный раствор приводит к рацемизации продукта.
Заявителем неожиданно был найден энантиоселективный способ получения S-энантиомера оптически активного циангидрина, при котором образуются продукты с высокой оптической чистотой и при котором не нужно использовать цианистоводородную кислоту и органический растворитель. S-циангидрины, произведенные от алифатических альдегидов, могут таким образом быть получены при помощи S-оксинитриллиазы.
Предметом изобретения является, следовательно, энантиоселективный способ получения S-энантиомера оптически активного циангидрина путем реакции обмена между альдегидом или несимметричным кетоном и донором циангруппы, который отличается тем, что проводится реакция обмена между альдегидом или кетоном в разбавителе в присутствии S-оксинитриллиазы и донором циангруппы, после чего осуществляется выделение образующегося циангидрина из реакционной смеси.
В качестве исходных материалов в предложенном в изобретении способе используются альдегид или несимметричный кетон, донор циангруппы, оксинитриллиаза и разбавитель.
В качестве альдегида используют алифатические или ароматические альдегиды. В качестве кетона используют метилкетон.
В качестве донора циангруппы применяется циангидрин общей формулы R1R2C(OH)(CN), в которой R1 и R2 независимо друг от друга означают алкильный остаток.
Получение донора циангруппы может осуществляться известными способами.
В качестве оксинитриллиазы применяется S-оксинитриллиаза, например, из рода Sorghum bicolor и Hevea brasiliensis. Наиболее подходящей оказалась оксинитриллиаза из рода Hevea brasiliensis. Оксинитриллиаза может при этом использоваться в очищенном или в неочищенном виде, как сама по себе или в иммобилизированной форме. Подготовка и очистка оксинитриллиазы может осуществляться, например, осаждением с сульфатом аммония и последующей фильтрацией через гель, как это показано в работе D.Selmar et al. Physiologia Plantarum 75 (1989), 97-101.
Способ, согласно изобретению, осуществляют в разбавителе. Особенно предпочтительным оказалось проводить реакцию обмена в водном разбавителе без добавок органических растворителей, которые сильно гасят активность фермента, причем, что неожиданно, не происходит рацемизации продукта. Однако, предложенный способ может также проводиться и в органическом разбавителе или в присутствии органического растворителя. Органический растворитель может при этом служить как сорастворитель в водной системе или как растворитель в двухфазовой системе, например, в мембранном реакторе. В качестве органических разбавителей могут использоваться: алифатические или ароматические углеводороды, галогенированные в соответствующих случаях; спирты; простые эфиры; сложные эфиры. В качестве органического сорастворителя могут использоваться смешивающиеся с водой органические растворители, как например, спирты, а в качестве растворителей в составе двухфазовой системы - несмешивающиеся с водой органические растворители, как например, алифатические или ароматические углеводороды, галогенированные при необходимости, а также простые и сложные эфиры. В качестве водного разбавителя используются вода, водный солевой или водный буферный раствор. Предпочтение отдается водному буферному раствору и особенно такому, который содержит цитрат натрия. Величина рН должна при этом быть ниже 7, предпочтительнее от 3 до 5.
На 1 г. альдегида или несимметричного кетона добавляют примерно от 150 до 300 г. разбавителя и оксинитриллиазу в количестве по меньшей мере 500, предпочтительно от 500 до 2000 МЕ активности.
На моль используемой альдегидной или кетонной группы используется не менее одного моля, а предпочтительнее от 1 до 2 молей донора циангруппы.
Процесс проводят путем встряхивания или перемешивания реакционной смеси при температуре примерно от 0 до температуры дезактивирования оксинитриллиазы, предпочтительнее при температуре от 20 до 30oС.
При этом циангруппа донора переходит к атому карбонильного углерода используемого альдегида или кетона и образуется преимущественно S-энантиомер оптически активного циангидрина, соответствующего используемому альдегиду или кетону. За ходом реакции следят методом газовой хроматографии.
После окончания реакции образовавшийся циангидрин экстрагируют из реакционной смеси при помощи органического растворителя, который не смешивается с водой, например, алифатическими или ароматическими, при необходимости галогенированными углеводородами, такими как пентан, гексан, бензол, толуол, метиленхлорид, хлороформ, хлорбензолы, простыми эфирами, такими как диэтиловым эфиром, диизопропиловым эфиром или сложными эфирами, например, этиловым эфиром уксусной кислоты или смесями таких растворителей. Если чистота экстрагированного продукта недостаточна, то затем может следовать операция очистки. Очистка может осуществляться каким-либо известным способом, но лучше всего ее проводить методом хроматографии.
В соответствии с предпочтительной формой осуществления производят встряхивание при комнатной температуре смеси из примерно 100 мг альдегида в водном буферном растворе в количестве от 15 до 30 г с рН равной примерно 4, содержащем цитрат натрия, вместе с 2 молями ацетонциангидрина на каждый моль используемой альдегидной или кетонной группы и оксинитриллиазой из Hevea Brasiliensis активностью 200 МЕ. За ходом реакции следят методом газовой хроматографии. После окончания реакции реакционную смесь экстрагируют метиленхлоридом, органическую фазу высушивают и упаривают. Последующую очистку остатка можно осуществлять методом колоночной хроматографии.
Пример 1.
100 мг капрональдегида (1 ммоль) растворяют в 20 мл 0,1 молярного цитратного буфера с величиной рН равной 4, к раствору добавляют 1 г ферментного неочищенного изолята с активностью 100 МЕ на грамм в виде высушенного лиофильной сушкой порошка, полученного в соответствии с методом D.Selmar et al. Physiologica Plantarum 75 (1989), 97-101, и 168 мг ацетонциангидрина (2 ммоля), и встряхивают смесь в устройстве для встряхивания в течение 2 часов при комнатной температуре. За ходом реакции следят с помощью газовой хроматографии. После окончания реакции трехкратно экстрагируют по 25 мл метиленхлорида. Органические фазы объединяют, сушат над сульфатом натрия и растворитель отгоняют в роторном испарителе.
При этом получают 114 мг, что составляет 90% от теоретического выхода, S-капрональдегидциангидрина с чистотой энантиомера 84%
Пример 2
Осуществляют взаимодействие между 80 мг бензальдегида (0,75 ммоля) и 128 мг ацетонциангидрина (1,5 ммоля), как это описано в примере 1, в 15 мл 0,1 молярного цитратного буфера (величина рН 4) и 1 г описанного в примере 1 ферментного изолята.
При этом получают 45 мг, что составляет 45% от теоретического выхода, S-бензальдегидциангидрина с чистотой энантиомера 94%
Определение оптической чистоты образующихся альдегидциангидринов осуществляют газохроматографическим методом на капиллярной колонке через ментилкарбонат в соответствии с методом J.W.Westley et.al. J.Org. Chem. 33 (1968), 3978-3980.
Определение оптической чистоты кетонциангидринов осуществляют газохроматографическим методом на хиральной разделительной фазе в соответствии с методом V.Schuig et. al. Ang. Chemie 102 (1990), 969-986.
Пример 3.
100 мг метиленпропилкетона (1,16 ммоль) растворяют в 15 мл 0,1 молярного цитратного буфера со значением рН 4, смешивают с 0,6 неочищенного ферментного изолята с активностью 100 МЕ на грамм в виде высушенного при вымораживании порошка (получен по D. Selmar и др. Physiologica Plantarun 75, 1989, 97-101) и с 198 мг ацетонциангидрина (2,32 ммоль) и встряхивают два часа при комнатной температуре. Реакцию контролируют с помощью газовой хроматографии. После установления равновесия газохроматографический анализ показан 40% метилпропилкетонциангидрина с энантиомерной чистотой 61%
Использование: в химико-фармацевтической промышленности в качестве полупродукта для синтеза биологически-активных веществ, таких как витамины, фармацевтически-активные вещества, пиретроидные соединения. Сущность изобретения, энантиоселективный способ получения S-энантиомера оптически-активного циангидрина. Пример. Реагент 1: соответствующий альдегид или метилкетон; Реагент II: донор циангруппы - R1R2C(OH)(CH)2, где R1, R2-алкил. Условия реакции: фермент S-оксинитриллиаза с активностью по меньшей мере 500, предпочтительно 500-2000 МБ, разбавитель, предпочтительно водный. В качестве донора желательно использовать ацетонциангидрин и S-оксинитриллиазу рода Неvea Brasiliens или Sorghum bicolol. Выделение и очистку осуществляют обычно хроматографией. 4 з.п. ф-лы.
R1R2C(OH)(CN),
где R1, R2 алкильный остаток,
в присутствии фермента с выделением образовавшегося циангидрина из реакционной смеси, отличающийся тем, что в качестве фермента используют S-оксинитриллиазу с активностью по меньшей мере 500, предпочтительно 500 - 2000 ME и процесс ведут в среде разбавителя при рН 3 5.
| JACS, 1991, 113, 6992-6996. |
