СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОПРОТЕАЗ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА Российский патент 1997 года по МПК C12N9/50 C12N9/66 C12N9/50 C12R1/38 

Изобретение относится к медицине и касается получения очищенных экзопротеаз возбудителя мелиоидоза и может быть использовано для изучения факторов патогенности данного микроорганизма, а также приготовления диагностических препаратов для их обнаружения.

Известны различные способы выделения и очистки протеолитических ферментов псевдомонад, которые включают методы осаждения и различные способы фракционирования. Получение и первичная характеристика эластазы штаммов P. aeruginosa показана в работах (K.Morihara, Pseudomonas aeruginosa proteinase. I. Purification and general properties // Biochem.Biophys.Acta, - 1963. -V.73, -P.118-124; Эль-Базза З.Е. Мороз А.Ф. Глотман Л.И. Ледвигова Г. А. Терехов А.А. Получение и первичная характеристика эластазы из клинического штамма Pseudomonas aeruginosa // Микробиология, 1988, N 11, с.6-11).

Наиболее близким является способ получения экзопротеаз из 8-суточной бульонной культуры возбудителя мелиоидоза. (Внеклеточные факторы патогенности возбудителя мелиоидоза: отчет НИР, заключительный Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. Рук. Ефременко В.И. Илюхин В.И. Волгоград, (1981 ГР 79074381, с.64). Способ представляет собой выращивание авирулентного пуринзависимого штамма P.pseudomallei VPA. в бульонной среде в течение 8 сут при 32^oC. Микробные клетки отделяли фильтрацией через ватно-марлевый фильтр, стерилизацию фильтрата осуществляли мертиолятом натрия 1: 5000.

Фракционирование 8-суточного фильтрата проводили ультрафильтрацией на волоконных фильтрах HХ50, с последующим осаждением белков сульфатом аммония при 65% а 70% и 100% насыщения. Проведена гельхроматография фильтрата на сефадексе G-200 и ультрагеле АкА-44. Выделенная белковая фракция обладала протеазной, казеиназной, эластазной и нейраминидазной активностью. Молекулярная масса белков протеазного комплекса определена в диапазоне от 8 до 30 кДа. Однако, необходимо отметить, что фильтраты, полученные при 8-суточном культивировании, содержат не только ферменты, но и большое число других метаболитов за счет интенсивного лизиса микробных клеток возбудителя мелиоидоза, что значительно затрудняет выделение и очистку экзопротеаз. Предложенные авторами методы выделения не позволяют получить протеолитические ферменты достаточной чистоты.

Цель изобретения разработка технологии выделения и очистки экзопротеаз возбудителя мелиоидоза, позволяющая увеличить степень очистки экзопротеаз с сохранением их нативных свойств.

Поставленная цель достигается при выделении экзопротеаз из 2 суточной бульонной культуры вирулентного штамма Pseudomonas pseudomallei 57576, осаждением белков при 80% насыщения сульфатом аммония и дальнейшей очистки ферментов последовательно методом гель-хроматографии на сефадексе G-25 и G-100 и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе А-50 и КМ сефадексе К-50.

Для получения экзопротеаз возбудителя мелиодиоза используют двух суточную бульонную культуру, в стационарной фазе роста, выращенную при 37^oC. Микробные клетки отделяют фильтрацией через фильтр "Владипор" N 3 при отрицательном давлении в 0,3 атм. В фильтрат добавляют мертиолят натрия 1: 10000. Суммарный белковый комплекс получают осаждением суьфатом аммония при 80% насыщения. Полученный препарат осаждают центрифугированием при 6000g 30 мин, 4^oC. От сульфата аммония белки отделяют гель-хроматографией на сефадексе G-25, элюируя 0,01 М фосфатным буфером pH 7,2. Протеолитический комплекс, выделенный сульфатом аммония, разделяют от балластных белков методом гель-хроматографии на сефадексе G-100. Элюацию осуществляют фосфатным буфером pH 7,2 под контролем спектрофотометра при длине волны 280 нм. Протеолитическую активность полученных фракций обнаруживают по гидролизу 0,25% молочно-солевого агара. Препарат экзопротеаз после хроматографии на сефадексе G-100 наносят на колонку с ДЕАЕ-сефадексом А-50 в Cl-форме и элюируют 0,01М фосфатным буфером pH 7,2 в градиенте NaCl от 0 до 0,5М. В результате выделяют 2 протеолитические фракции. Первая элюируется в свободном объеме, вторая фракция обозначенная как П-II в градиенте NaCl 0,25М. Обе фракции обладают казеиназной и желатиназной активностями, первая фракция также гидролизует эластин.

Фракцию экзопротеаз, элюирующуюся в свободном объеме, концентрируют, диализуют против стартового буфера и наносят на колонку с КМ сефадексом К-50 в Na-форме, уравновешенной 0,01М трис-буфером pH 5,8. Элюацию проводят 0,01М трис-буфером pH 5,8 и градиенте NaCl от 0 до 0,5М. В результате элюации выделяют 2 фракции белков, обладающих протеолитической активностью. Первая фракция определяется в свободном объеме и обладает эластазной активностью и обозначена П-III; вторая протеолитическая фракция элюируется при концентрации NaCl, соответствующей 0,15М. Эта фракция обозначенная как П-I обладает казеиназной и желатиназной активностью. В результате из суммарного комплекса Pseudomonas pseudomallei 57576 выделено 3 экзопротеазы, одна из которых обладает эластазной активностью.

Таким образом, благодаря совокупности предлагаемых приемов получены три очищенные экзопротеазы P. pseudomallei с сохранением их нативных свойств. Полученные препараты могут быть использованы для изучения биологии возбудителя мелиоидоза, получения диагностических сывороток и тест-систем, определяющих протеазы P. pseudomallei, а также как компонент химической вакцины.

Пример 1. Подбор штамма продуцента экзопротеаз возбудителя мелиоидоза.

Из различных штаммов возбудителя P. pseudomallei 100, 111, 114, 97, 57576, 107, VPA получены препараты экстрацеллюлярных протеаз после 1, 2, 3, 4 суточного выращивания. Изучение динамики проявления данного признака в бульонной культуре исследуемых штаммов показало, что после 48 ч выращивания продукция протеаз была максимальной.

Также установлено, что среди изученных штаммов наиболее выраженной протеолитической активностью обладает типичный вирулентный штамм P. pseudomallei 57576. (см. табл. 1)
Пример 2. Определение степени осаждения экзопротеаз сульфатом аммония.

Соответствующую сухую навеску сульфата аммония дробно добавляют к охлажденному до 4-8^oC фильтрату бульонной культуры P. pseudomallei 57576 для достижения степени насыщения солью от 20 до 80% (см. табл. 2). Пробу тщательно перемешивают до полного растворения соли, для поддержания pH 8,2 добавляют 10% раствор аммиака. После инкубации при 4^oC в течение 18 ч осадок белков отделяют центрифугированием 6000g 30 мин, 4^oC.

Экзопротеазы осаждаются в широком диапазоне степени насыщения сульфатом аммония от 30 до 80% Наибольший выход ферментов наблюдается при 60-80% насыщения. Максимальное осаждение экзопротеаз происходит при 80% насыщения. Данную концентрацию соли использовали в последующих исследованиях для выделения экзопротеаз возбудителя мелиоидоза (см. табл. 2).

Пример 3. Подбор оптимальных условий выделения экзопротеаз.

С целью подбора оптимальной технологии выделения экзопротеаз возбудителя мелиоидоза исследованы разные схемы очистки экзоферментов. Суммарный белковый комплекс осажденный при 80% насыщения сульфатом аммония от балластных белков отделяют гель-хроматографией на сефадексе С-100, белковую фракцию с протеолитической активностью разделяют методом ионообменной хроматографии на сефадексе КМ-К-50 в Na-форме при pH 7,0. Оценка протеолитической активности и степени очистки ферментов 10,8 (см. табл. 3) свидетельствуют о том, что данная схема очистки не позволяет разделить ферменты и балластные белки. В дальнейших исследованиях был изменен заряд ионообменника КМ сефадекса К-50 в Н-форме и pH 5,2. Данный метод разделения также был не достаточно эффективен. Степень очистки повысилась на 0,3.

Введение еще одного этапа очистки ионообменной хроматографии на ДЕАЕ сефадексе А-50 в Cl-форме pH 7,2 способствует разделению балластных белков и получению протеолитического комплекса, который дополнительно разделяют на КМ сефадексе К-50 в Na-форме pH 5,8. Такая схема очистки позволяет получить 3 протеазы P. pseudomallei 57576 без примеси других метаболитов и высокой степенью очистки 41-57 раз.

Пример 4. Изучение физико-химических свойств и субстратной специфичности полученных экзопротеаз возбудителя мелиоидоза.

Для изучения физико-химических свойств используют комплекс экстрацеллюлярных антигенов и очищенные экзопротеазы P. pseudomallei 57576. Определение молекулярной массы очищенных ферментов, изоэлектрических точек, оптимума pH и температуры проводят общеизвестными способами. Субстратную специфичность оценивают на агаровых пластинах с соответствующими субстратами (табл.4).

Отмечено, что исходный препарат экстрацеллюлярных антигенов проявляет протеазную, эластазную, гемолитическую, фосфолипазную, лецитиназную активность. Очищенные предлагаемым способом протеазы обладают только протеолитической активностью и не ферментируют лецитин, Твин-20, p-нитрофенилфосфорилхолин, что свидетельствует о чистоте протеолитических ферментов полученных по предложенной схеме. Три выделенные протеазы из P. pseudomallei 57576, также различаются между собой по молекулярной массе, изоэлектрическим точкам, субстратной специфичности, способности разрушать эритроциты барана, чувствительности к ингибиторам, что позволяет дифференцировать их.

Пример 5. Изучение биологических свойств экзопротеаз.

Введение морским свинкам внутрикожно выделенного суммарного комплекса экзопротеаз показало, что минимальная концентрация ферментов, вызывающих дермонекротическую реакцию, составляет 2-4 мкг. Исследуя действие отдельных протеаз возбудителя мелиоидоза обнаружено, что протеаза I и протеаза III при внутрикожном введении в дозе 5 мкг вызывает дермонекротическую реакцию, а введение протеазы II только гиперемию и отек. Таким образом, выделенные отдельные протеазы P. pseudomallei различаются по способности вызывать некроз тканей. Отмечено, что при внутрикожном введении прогретых до 100^oC 15 мин препаратов протеаз кожная реакция у морских свинок не проявлялась.

В опытах по изучению возможного токсического действия экзопротеаз используют белых мышей, которым вводили внутрибрюшинно от 10 до 200 мкг (см. табл. 5).

Результаты показали, что выраженной токсичностью обладает протеаза III (эластаза) которая снижает выживаемость животных на 40%
Пример 6. Получение тест-системы для выявления экзопротеаз возбудителя мелиоидоза.

Гипериммунные кроличьи сыворотки к комплексу очищенных протеаз возбудителя P. pseudomallei 57576 получают путем внутрикожных инъекций препарата в дозе 200 мкг с неполным адъювантом Фрейнда четырехкратно, с интервалом 1 нед. Курс состоит из двух циклов. Из полученных сывороток выделяют иммуноглобулины на основе которых традиционным способом получают эритроцитарный диагностикум для постановки РНГА и иммунопероксидазный конъюгат для постановки ТИФА (см. табл. 6).

Полученные эритроцитарные и иммуноферментные тест-системы на основе иммуноглобулинов к экзопротеазам возбудителя мелиоидоза обладают достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать их в широком спектре исследования по изучению биологии возбудителя мелиоидоза.

Таким образом, благодаря использованию предложенной технологической схемы очистки экзопротеаз из вирулентного штамма P. pseudomallei 57576 было выделено 3 протеолитических фермента с увеличением степени очистки в 41-57 раз. Определены физико- химические характеристики выделенных ферментов. По субстратной специфичности протеаза III определена как эластаза мелиоидозного микроба. Изучены патогенетические и иммуногенные свойства протеаз. Используя иммуноглобулины к экзопротеазам получены эритроцитарные и иммуноферментные тест-системы, которые обладали достаточно высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет использовать их в широком спектре исследований возбудителя мелиоидоза и других близкородственных псевдомонад.

Использование: биотехнология, медицина, касается получения высокоочищенных протеолитических ферментов P.pseudomallei, пригодных для изучения биологии мелиоидозного микроба, получение диагностических тест-систем для их детекции. Сущность изобретения: для выделения ферментов предложено использовать 2-х суточную бульонную культуру вирулентного штамма Pseudomonas pseudomallei 57576, осаждение белков при 80% насыщении сульфатом аммония, отделение балластных белков методом гель-хроматографии на сефадексе G-25 и G-100, дальнейшую очистку ферментов методами ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе А-50 при pH 8,2 и КМ сефадексе К-50 при рН 5,2. Полученный предложенным способом экзопротеазы превосходят по степени очистки в 4-10 раз по сравнению с прототипом и обладают высокой ферментативной активностью и субстратной специфичностью. 6 табл.

Способ получения экзопротез возбудителя мелиоидоза, предусматривающий приготовление бульонной культуры штамма Pseudomonas pseudomallei, отделение экзопротез осаждением сульфатом аммония и последующую очистку гель-хроматографией на сефадексе, отличающийся тем, что приготавливают двухсуточную бульонную культуру вирулентного штамма Pseudomonas pseudomallei 57576, выделение экзопротеза проводят осаждением при 80% насыщения сульфатом аммония, а очистку последовательно гель-хроматографией на сефадексе G-25 и G-100, при рН 7,2 7,5 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе А-50 и КМ-сефадексе К-50, используя для десорбции градиент концентрации NaCl от 0 до 0,5 М.