ПЕПТИДНЫЙ ФРАГМЕНТ, ОБЛАДАЮЩИЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ИНСУЛИНА Российский патент 1997 года по МПК C07K7/06 C07K14/62 A61K38/28 

Изобретение относится к медицинской биохимии, в частности к новому фрагменту, обладающему биологической активностью инсулина.

Согласно современному уровню знаний для проявления биологической активности аналоги инсулина должны обладать определенными структурными и химическими свойствами.

Установлено, что наличие остатка аргинина B22 необходимо для проявления активности инсулина. С другой стороны, укороченные пептидные аналоги B-цепи инсулина, содержащие аргинин B22, но не содержащие ароматических аминокислот B24-B26, после комбинации с природной A-цепью инсулина проявляют слабую активность [1]
Известен ряд пептидных фрагментов, не являющихся структурными аналогами инсулина, которые проявляют остаточную биологическую активность инсулина in vivo и in vitro.

Так синтетические пептидные фрагменты Arg-Gly-Phe-NH₂ и Arg-Gly-Phe-Phe-NH₂ проявляют слабую биологическую активность in vivo и in vitro по сравнению с активностью инсулина [2]
Известен также малоактивный пентапептидный фрагмент B22 26 Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr B-цепи инсулина, содержащий активный центр молекулы. Этот гидрофобный участок на C-конце B-цепи молекулы инсулина является важнейшей областью, ответственной за связывание с рецептором, биологическую активность, образование димеров [3]
Известны дезоктапептид B-цепи инсулина и дезаспарагин A-цепи инсулина, обладающие утраченной в значительной степени биологической активностью и являющиеся фрагментами протеолитической деградации молекулы инсулина [4]
Известно, что C-концевой участок A-цепи инсулина A20 21 (Cys-Asn) также чрезвычайно важен для проявления инсулином биологической активности. Так дезаспаргин инсулин обладает слабой активностью, менее 4 активности нативного гормона (Ying-Chi Chu and Coworkers. Biochemistry. 1987, v. 26, p. 6966 6971).

Анализ данных об аминокислотных остатках, непосредственно участвующих и ответственных за связывание с рецептором и проявление биологической активности инсулина, приводит к выводу, что район связывания с рецептором сформирован на C-концевых участках B- и A-цепи инсулина (Kirsten Drejer. Diabetes/Metabolism Reviews. 1992, vol. 8, p. 259 286).

Примененный метод компьютерного моделирования пространственной структуры молекулы инсулина, анализ локализации аминокислотных остатков, ответственных за связывание с рецептором, показал, что все они пространственно сближены между собой и формируют область активного центра инсулина, ответственную за связывание с рецептором и проявление биологической активности. Эта область непосредственно сформирована аминокислотными остатками B-цепи (19 26) и A-цепи (20 21). Сближенность в пространстве участков A20 21 и B19 26 обусловлена наличием дисульфидной связи между цистеинами в позициях B19 и A20.

Задача изобретения поиск и создание биологически активного пептидного аналога инсулина на основе обобщенных данных в этой области.

Поставленная задача решена тем, что синтезирован новый пептидный фрагмент общей формулы HOOC-Asn-Cys-S-S-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-COOH, непосредственно ответственный за связывание гормона с рецептором и обладающий сравнимой с нативным гормоном биологической активностью при использовании одинаковых концентраций для биологического тестирования.

Предлагаемый декапептидный фрагмент инсулина (ДП) и его свойства в литературе не описаны.

Предложенный ДП состоит из двух пептидов (дипептид и октапептид, составляющие вместе центр связывания с рецептором), связанных между собой и структурно застабилизированных дисульфидной связью.

Основные преимущества в получении ДП связаны с использованием стандартных методов твердофазного синтеза на автоматической аппаратуре, щадящих условий снятия со смолы пептидов и боковых защитных групп, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для очистки пептидов.

Для получения предлагаемого пептидного фрагмента предварительно проводят синтез его составляющих: дипептида (Cys-Asn) и октапептида (Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr). Синтез проводят на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431A дициклокарбодиимидным методом в присутствии 1-гидроксибензотриазола с использованием 9-флуоренилметокси-карбонил-(Fmoc)-защищенных аминокислот.

В качестве твердой фазы для синтеза октапептида используют смолу p-Benzyloxybenzyl Alcohol Resin (Novabiochem). Синтез дипептида проводят с использованием смолы Fmoc-Asn-(Mbh)Resin (Novabiochem), где Mbh-4,4-диметилокисибензгидрил. Снятие пепетидов со смолы также, как и снятие всех боковых групп, кроме ацетамидометил-(Acm) защитной группы цистеина, проводят инкубацией в течение 4 ч в атмосфере азота в следующей смеси, трифторуксусная кислота (ТФУ) 90; тионизол 5; этандитиол 3, анизол 2.

Полученные пептиды очищают от избытка реагентов методом ВЭЖХ с помощью градиентного элюирования ацетонитрилом в 0,1-ной ТФУ на колонке диасорб 130 C-16/T, фракции с пептидным материалом лиофилизируют.

Пример конкретного получения фрагмента инсулина ДП.

Образование дисульфидной связи между дипептидом и октапептидом проводят следующим образом.

Дипептид и октапептид (по 10 мM), содержащие Acm-защитные группы цистеина, растворяют в 70 мл смеси метанола и воды (1 6) при комнатной температуре. К полученному раствору постепенно, в течение 75 мин при постоянном перемешивании добавляют 10 мл 2 мМ-ного раствора йода в метаноле. Раствор охлаждают до 0^oC и добавляют 1 M раствор тиосульфата натрия до исчезновения желтого окрашивания, затем добавляют избыток тиосульфата натрия. Метанол отгоняют на роторном испарителе, водную фракцию с пептидным материалом лиофилизируют.

Полученный лиофилизат, содержащий смесь пептидов в пептидный фрагмент ДП, растворяют в 30-ной уксусной кислоте и после удаления нерастворимого осадка разделяют методом ВЭЖХ на колонке Ultropack ODS-120 с помощью градиентного элюирования ацетонитрилом в 0,1-ной ТФУ на протяжении 60 мин при скорости элюции 1мл/мин. Детектирование при 214 и 254 нм. Собирают три пептидосодержащие фракции: фракция 1 (время удержания 40 мин) содержит 57 материала, фракция 2 (время удержания 44 мин) 20 а фракция 3 (время удержания 48 мин) 23 Собранный материал высушивают по фракциям и сохраняют при 4^oC.

Материал фракции 1 при рехроматографии методом ВЭЖХ в тех же условиях дает единственный пик с временем удержания 40 мин и поглощением в ультрафиолете при 254 нм (за счет остатка тирозина) и 214 нм (за счет пептидной связи).

Аминокислотный анализ: Asp 1,0 (1), Glu 1,3 (1), Gly 2,2 (2), Tyr 0,85 (1), Phe 1,9 (2), Arg 1,1 (1), Cus не определяли.

Результаты анализа аминокислотного состава фракции 1 (состав соответствует заданной для синтеза структуре), присутствие единственного пептидного пика при использовании метода ВЭЖХ с соответствующими спектральными данными, после окончательной очистки (рехроматография) свидетельствует о соответствии синтезированного материала предлагаемому фрагменту инсулина, состоящему из двух пептидов (дипептид Cys-Asn и октапептид Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr), соединенных между собой дисульфидной связью. Выход целевого пептидного фрагмента ДП в расчете на исходный октапептид составляет 20
Проведены биохимические исследования предложенного пептидного фрагмента инсулина ДП.

На фиг. 1 представлен график влияния инсулина и пептидов на синтез гликогена в адипоцитах; на фиг. 2 график влияния инсулина и пептидов на поглощение [C-14]-глюкозы клетками L-929; на фиг. 3 график влияния инсулина и/или ДП на биосинтез ДНК.

Реактивы: инсулин (активность 40 ед./мл, 0,13 ед. 0,83 нмоль), Россия; [C-14] глюкоза (специфическая активность 1500 ГБк/моль), "Изотоп", Россия; [C-14] тимидин (специфическая активность 1850 ГБк/моль), "Изотоп", Россия.

Отличительные особенности и преимущества предлагаемого ДП станут понятными из приведенных ниже примеров.

Пример 1. Влияние инсулина и инсулиновых пептидов ДП и тетрапептида (ТП), представляющего собой инсулиновый фрагмент B(22 25) Arg-Gly-Phe-Phe (Biologically active peptides, Novabiochem, коммерческий препарат), на биосинтез гликогена в адипоцитах крыс.

Адипоциты, полученные из эпидидимальной жировой ткани крыс, инкубируют при 37^oC с 0,5 мкКи [C-14]-глюкозы в среде, содержащей инсулин, ДП или ТП (контрольные адипоциты не содержат ростовых факторов). Через 10 и 20 мин инкубации определяют количество радиоактивности в гликогене. Обнаружено, что ДП и ТП обладают способностью увеличивать (хотя и в меньшей степени, чем инсулин) скорость включения [C-14] -глюкозы в гликоген адипоцитов крыс, причем количество включившейся за 20 мин [C-14]-глюкозы для инсулина, ДП и ТП составляет соответственно 185, 155, 125 по отношению к контролю (см. фиг. 1).

Пример 2. Сравнительное исследование влияния инсулина и инсулиновых пептидов ДП и ТП на поглощение [C-14]-глюкозы культивируемыми клетками L-929 (фибробластоподобные клетки фибросаркомы мышей).

Клетки, находящиеся в состоянии конфлюента, в течение суток культивируют в глюкозодефицитной среде, после чего в среду вносят инсулин или инсулиновые пептиды (ДП, ТП) в концентрации 0,01 2 мкМ, инкубируют в течение 3 ч, затем добавляют 0,5 мкКи/мл [C-14] -глюкозы. Через 10 мин инкубации с меченой глюкозой определяют количество поглощенной клетками радиоактивности. Показано, что оба инсулиновых пептида стимулируют поглощение [C-14]-глюкозы, однако ДП значительно активнее, чем ТП. В концентрации 0,1 мкМ ТП не влияет на поглощение глюкозы, а ДП стимулирует поглощение на 180 по сравнению с контролем. В концентрации 1 мкМ ТП стимулирует поглощение [C-14]-глюкозы примерно на 150 а ДП на 305 В концентрации 2 мкМ ТП стимулирует поглощение [C-14]-глюкозы на 200 а ДП на 360 (см. фиг. 2).

Пример 3. Конкурентные взаимоотношения инсулина и ДП показаны на примере влияния инсулина и ДП на биосинтез ДНК (по включению [C-14]-тимидина в клетки, определяемому по методу Rotella C.M et al. Horm. Metad. Res. 981, v.13, p. 565 569).

Перед экспериментом субъконфлюэнтные культуры синхронизируют в среде 199, содержащей 0,5 сыворотки, в течение 48 ч с ежедневной сменой среды. После этого среду меняют на бессывороточную среду с различными дозами инсулина или ДП. Через 21 ч добавляют [C-14]-тимидин (5 мкКи/мл) и инкубируют при 37^oC в течение 4 ч. Реакцию останавливают, помещая клетки в лед, промывают холодным фосфатным буфером (или средой Хенкса). Клетки фиксируют в смеси спирта и уксусной кислоты (9 1) лизируют 0,3 н. KOH и радиоактивность лизата считают в жидкости Брея в сцинтилляционном счетчике. Обнаружено, что при добавлении к клеткам инсулина в концентрации 0,05 и 0,1 мкМ биосинтез ДНК возрастает и составляет соответственно 160 и 220 по сравнению с контролем. ДП в концентрации 0,1 и 1 мкМ усиливает биосинтез ДНК соответственно на 120 и 145 Совместное добавление инсулина и ДП вызывает такое же усиление синтеза ДНК, что и добавление одного инсулина (см. фиг.3).

Предложенный пептидный фрагмент, обладающий биологической активностью, сравнимой с активностью инсулина, может найти применение в медицине как основа для разработки в дальнейшем лекарственной формы пептидного препарата, используемого при терапии инсулинозависимого диабета, а также в фундаментальных научных исследованиях механизмов молекулярного узнавания (гормон-рецептор).

Использование: в медицинской биохимии. Сущность: продукт декапептидный фрагмент формулы HOOC-Asn-Cys-S-S-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-COOH, обладающий биологической активностью инсулина. Реагент 1: дипептид Cys-Asn, реагент 2: октапептид Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr. Условия реакции: синтез проводят на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431A дициклокарбодиимидным методом в присутствии 1-гидроксибензотриазола с использованием 9-флуоренилметоксикарбонил-(Fmoc)-защищенных аминокислот. Выход 20 %. 3 ил.

Пептидный фрагмент формулы HOOC Asn- Cys S S -Cys-GIy - GIy-Arg-GIy-Phe-Phe-Туr-COOH, обладающий биологической активностью инсулина.