Способ антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 

Это достигается тем, что антигенная дифференциация штаммов вируса клещевого энцефалита включает постановку иммунологической реакции специфической сыворотки к прототипному штамму с антигеном, приготовленным из испытуемого штамма, учет результатов реакции и заключение о штаммовой принадлежности испытуемого штамма. Новым в достижении цели является то, что в качестве серологической реакции используют реакцию связывания комплемента, в качестве специфической сыворотки используют иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена - сахарозо- ацетоновый и растворимый антиген. При этом постановку реакции связывания комплемента проводят раздельно с сахарозо- ацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25% и более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров 6,25% и менее - как гетерологичный прототипному.

Способ осуществляется следующим образом, Суспензией мозга мышей, инфицированных прототипными штаммами вируса клещевого энцефалита Софьин (восточный подтип), А-53 (сибирский или Айна/1448 - подтип), Преголя - 8 (западный подтип), заражают в мозг необходимое количество мышей-сосунков и через 3-4 сут проводят сбор сосунков с типичными признаками болезни. Отобранных мышей обескровливают разрезом грудной клетки, извлекают мозг и помещают в охлажденный стакан гомогенизатора тканей. К мозгу мышей добавляют охлажденный до +4UC 8,5%-ный раствор сахарозы из расчета 0,4 мл раствора на 1 мозг и измельчают до получения однородной массы. Ацетоновую экстракцию проводят трехкратно, используя предварительно охлажденный до -15°С ацетон квалификации ч. Для первой обработки берут 20-ть объемов ацетона на 1 объем вируссодержащей суспензии мозга. Суспензию осторожно, по каплям добавляют в центрифужный стакан с охлажденным ацетоном при непрерывном перемешивании. Затем взвесь центрифугируют при2000 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость (ацетон). Для второй обработки берут свежую порцию ацетона в 20-кратном объеме и добавляют к осадку. Осадок тщательно разбивают фарфоровым или стеклянным пестиком до образования равномерной взвеси и выдерживают в течение 1 ч при температуре +4°С и периодиче- ском перемешивании. Затем взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин и ацетон осторожно отсасывают. При третьей обработке к полученному осадку добавляют свежую порцию ацетона в небольшом произвольном количестве, смесь тщательно перемешивают, центрифугируют, удаляют ацетон, а осадок высушивают

под вакуумом до превращения его в сухой рассыпчатый порошок. К порошкообразному осадку добавляют 0,1 М трис-буферный раствор до объема первоначальной суспензии мозга. Для инактивации вируса к пол0 ученному антигену добавляют /J-пропиолактон до конечной концентрации 0,1% и выдерживают в течение 24 ч при температуре +4°С. Антиген центрифугируют на холоде (+4° С) в течение 1 ч при

5 10000 об/мин. После центрифугирования инактивация продолжается еще в течение трех суток. Контроль инактивации осуществляют заражением 5-7-граммовых белых мышей в мозг по 0,02 мл неразведенным

0 антигеном и последовательными его разведениями 10 , 10 . Зараженных животных наблюдают в течение 15 суток. Стерильный 7%-ный раствор бычьего альбумина на бо- ратном буферном растворе рН 9,0 соединя5 ют с антигеном до конечной концентрации 0,7%. Приготовленный сахарозо-ацетоно- вый антиген делят на две части и из одной его части готовят растворимый антиген. Для этого к сахарозо-ацетоновому антигену до0 бавляют сухую мочевину до конечной концентрации 8М, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, после чего диализируют в течение 20-24 ч против 100 объемов борат- ного буфера рН 9,0 при 4°С для удаления

5 мочевины из препарата. У исходного саха- разо-ацетонового антигена и полученного растворимого антигена определяют гемаг- глютинирующую активность (растворимый антиген не должен обладать способностью

0 агглютинировать эритроциты гуся). Затем са- харозо-ацетоновый и растворимый антигены известных и испытуемых штаммов титруют в реакции связывания комплемента с иммунными асцитными жидкостями (сы5 воротками), полученными к штаммам - представителям известных антигенных подтипов вируса клещевого энцефалита.

В результате перекрестного титрования в реакции связывания комплемента сахаро0 зо-ацетонового и растворимого антигенов штаммов вируса клещевого энцефалита и полученных против них иммунных асцитов устанавливают, что в гомологичной системе падение титра растворимого антигена по

5 сравнению с исходным титром сахарозо- ацетонового антигена ни в одном случае не превышает 4-кратного. В гетерологичной системе снижение титра растворимого антигена по отношению к исходному титру са- харозо-ацетонового антигена отмечено в

интервале 4-32 раза(25-3,1%). Исходя из этих данных,устанавливают количественные критерии антигенной квалификации того или иного штамма (т.е. при значении 25% и более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при значении 6,25% и менее - как антигенно отличный от прото- типного).

Пример. Для исследования выбирают штаммы Софьин, А-53 - клон штамма Айна/1448, Тенис, Бузуучук, Нугуш, 4072. Преголя-8 и Скалица. Приготовляют сахаро- зо-ацетоновый и растворимый антигены по вышеописанной методике. Против указанных штаммов получают иммунные асцитные жидкости (ИАЖ), которые используют для перекрестного титрования сахарозо-ацето- нового и растворимого антигенов в реакции связывания комплемента (РСК).

Результаты исследования представлены в таблице.

Как видно из данных таблицы, при использовании сахарозо-ацетонового антигена (САЛ) разница в титрах с гомологичной и гетерологичными ИАЖ, как правило, не превышает двукратной, и в случае растворимого антигена (РА) - достигла 32 раз В то же время отмечают, что в гомологичной системе титр РА постоянно снижается не более, чем в 4 раза, по сравнению с титром исходного САА, из которого данный РА получают. В реакции с ИАЖ к другим антигенным подтипам разница в титрах САА и РА одного и того же штамма стабильно составляет 16 и более раз. РА штаммов вируса КЭ не реагирует с ИАЖ к вирусам ОГЛ и Повассан. Эти наблюдения позволяют установить количественные критерии дифференциации штаммов вируса КЭ. Уровень антигенного родства штаммов таким образом может быть выражен формулой НАГ :

Титр РА

100%.

Титр САА

Из данных таблицы ел едует,чтоприНАг 25% штаммы, использованные для получения антигенов и антител, антигенно родственны, а при НАГ 6,25% - относятся к разным антигенным подтипам.

Анализ полученных данных в отношении 8-ми штаммов вируса КЭ показывает, что помимо представителей трех антигенных подтипов вируса КЭ (Софьин - дальневосточный подтип, А-53 - сибирский или Айна/1448 -подтип и Преголя-8-западный подтип), выявляются еще две антигенные группы. Одна из них представлена штаммами Нугуш и 4072, другая штаммом Бузуучук. Кроме того, имеются штаммы, обладающие антигенным родством с представителями двух разных вариантов. Таковы штаммы Тенис и Скалица. Полученные данные иллюстрируют более высокую точность предлагаемого способа, а также его широкие возможности для антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита.

В целом вопрос об антигенной вариабельности вируса КЭ до настоящего времени не является достаточно ясным и требует скорейшего разрешения. С ним, в частности, связано адекватное решение проблем

лабораторной диагностики, специфической профилактики итерапии КЭ. Изучение этого вопроса также важно для познания и прогнозирования процессов изменчивости вируса, особенно в связи с возрастающими

масштабами и темпами антропогенного воздействия на природные очаги КЭ.

Формула изобретения Способ антигенной дифференциации

штаммов вируса клещевого энцефалита, включающий постановку иммунологической реакции специфической сыворотки к прототипному штамму с антигеном, приготовленным из испытуемого штамма, учет

результатов реакции и заключение о штам- мовой принадлежности испытуемого штамма, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве серологической реакции используют реакцию связывания комплемента, в качестве специфической сыворотки - иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена - сахарозо-ацетоновый и растворимый антиген, при этом постановку реакции связывания комплемента проводят раздельно с сахарозо-ацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25% и более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров

6,25% и менее - как гетерологичный прототипному.

Использование: в медицине, вирусологии. Сущность изобретения: антигенную дифференциацию штаммов вируса клещевого энцефалита проводят путем постановки реакции связывания комплемента, используя в качестве специфической сыворотки иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена - сахарозо-ацетоновый и растворимый антиген, при этом постановку реакции проводят раздельно с сахарозо- ацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25% и выше штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров 6,25% и менее - как гетерологичный прототипному. 1 табл Наиболее близким к предлагаемому является способ внутривидовой антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита, включающий диффузию в геле с помощью сывороток, адсорбированных гетерологическими вирусами. Однако известный способ имеет следующие недостатки Практика использования способа показывает, что он является трудоемким из-за необходимости получения куль- туральных концентрированных антигенов прототипных и испытуемых штаммов, для чего требуется большое количество дорогостоящих клеточных культур, импортных химреактивов и дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуга). Кроме того, способ менее точен из-за отсутствия количественной оценки внутривидовой антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа J(Л С Ч| СА СП 00 ON ГО fe