СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТАМИНА СУЛЬФАТА (САЛЬМИНА) ИЗ ПОЛОВОЗРЕЛЫХ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ ПОРОД РЫБ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/60 C07H21/04 

Bзобретение относится к медицине, в частности к производству фармацевтической субстанции протамина сульфат (сальмин). Эта субстанция для обеспечения требуемой активности должна обладать определенной степенью чистоты от сопутствующих посторонних белков.

По известному способу из молок рыб одновременно получают протамина сульфат и дезоксирибонуклеиновую кислоту. Предварительно измельченные молоки экстрагируют раствором хлористого натрия и выделяют дезоксирибонуклеиновую кислоту известными методами. Остаток после ее отделения обрабатывают 5%-ным раствором серной кислоты, центрифугируют и осаждают ацетоном. Полученный осадок промывают горячей, подщелоченой раствором аммиака, водой до растворения при рн 8,0-9,0, осаждают ацетоном и сушат.

Недостатком этого способа является наличие повышенного количества сопутствующих посторонних белков и нуклеиновых кислот (РНК и ДНК), что является результатом неудовлетворительного их отделения и тем самым обуславливает невысокую антигепариновую активность (Н.И.Супрунов, В.А.Рассказов, Б.А.Алексеенко и В.И.Головлев. Способ совместного получения протамин-сульфата и дезоксирибонуклеиновой кислоты. Авторское свидетельство №473720. Заявлено 15.09.1972).

Известен способ производства протамина сульфата, в большей степени свободный от недостатков вышеприведенных способов (Т.Ю.Андреечива, А.В.Баланда, Г.М.Горшкова, И.А.Донецкий, С.П.Карасенко, П.М.Кочергин, Е.И.Люстгартен, М.Ю.Мазов, И.А.Маругин. Способ получения протамина. Авторское свидетельство №1072311. Заявлено 07.07.81).

По этому способу молоки предварительно измельчают, обезвоживают, обезжиривают, высушивают, измельчают и экстрагируют 4%-ным раствором серной кислоты с последующим осаждением ацетоном. Затем осадок растворяют в горячей воде (55-60°С), обрабатывают кристаллическим гидратом окиси бария до рН 7,5, подщелачивают концентрированным раствором аммиака до рН 8,5-9,5 и добавляют активированный уголь. После центрифугирования и промывания осадка проводят обессоливание раствора протамина сульфата с последующим его осаждением ацетоном.

Однако такой способ имеет ряд существенных недостатков, состоящих в недостаточной степени очистки целевого продукта от сопутствующих белков и реакционных примесей, а именно: применение на всех стадиях производства ацетона приводит к тому, что в конечном продукте содержание ацетона значительно превышает существующие нормы; применение активированного угля изменяет цвет конечного продукта, что не соответствует существующим требованиям; применение кристаллического гидрата окиси бария не дает полного осаждения избытка серной кислоты, что снижает эффективность последующих стадий очистки и выделения протамина сульфата.

По известному способу производства протамина сульфата (Маругин И.А., Волков В.В., Ивченко В.Ф., Силаев В.Г. Способ производства протамина сульфата из молок половозрелых рыб, патент на изобретение № 2197254) молоки вываривают в кипящей воде, измельчают, обрабатывают ацетоном, высушивают до образования гранул, экстрагируют 4%-ным раствором серной кислоты, осаждают белки из экстракта добавлением двойного объема спирта, растворяют осадок в горячей воде, обрабатывают раствор гидратом окиси бария до рН 7,0-7,5, добавляют раствором аммиака до рН 9,0-9,5, отделяют осадок декантацией и центрифугированием, обрабатывают маточный раствор и центрифугат кизельгуром, фильтруют на нутч-фильтре, проводят фильтрат через катионит в Н-форме для отделения минеральных солей, концентрируют элюат упариванием под вакуумом или баромембранным методом, осаждают целевой продукт из элюата двукратным объемом спирта, осадок высушивают при температуре 55-65°С в течение 7-12 часов.

Известен способ производства протамина сульфата, по которому нежирные молоки лососевых рыб обрабатывают разбавленным раствором уксусной кислоты при нагревании и, минуя стадии обезжиривания и обезвоживания, протамины экстрагируют 1%-ным раствором серной кислоты, а образующийся протамина сульфат осаждают этанолом (Н.Е.Николаева и Л.В.Сысоева. Способ получения протамина (сальмина). Авторское свидетельство №170147. Заявлено 30.05.1964).

Недостатком такого способа являются ограничения при отборе исходного сырья (только нежирные молоки), а также наличие большого количества сопутствующих посторонних белков и липидов, что является следствием их неудовлетворительного отделения и, тем самым, обуславливает невысокую антигепариновую активность, а также низкий процент выхода готового продукта.

Этот способ принят за прототип.

Однако такой способ имеет ряд существенных недостатков, состоящих в недостаточной степени очистки целевого продукта от сопутствующих белков и реакционных примесей, а именно: обработка неизмельченных молок разбавленной уксусной кислотой, минуя стадию обезвоживания и обезжиривания, не позволяет перевести исходное сырье в сухие гранулы для улучшения процесса экстракции протамина серной кислотой. Проведение однократной экстракции разбавленной серной кислотой резко понижает экстрагируемость протамина. Применение активированного угля в качестве сорбента при нагревании маточного раствора и центрифугата перед фильтрацией на нутч-фильтре изменяет цвет конечного продукта, что не соответствует требованиям НД.

Для получения протамина сульфата (сальмина) повышенной антигепариновой активности необходимо повысить экстрагируемость протамина из молок раствором серной кислоты. Этого можно достичь путем предварительного перевода сырых молок в сухие гранулы, трехэтапной экстракции протамина из гранул растворами серной кислоты различных концентраций, а также обработки маточного раствора и центрифугата кизельгуром при нагревании до 80°С перед фильтрацией на нутч-фильтре.

Сырые молоки измельчают и обрабатывают 2,5-кратным объемом 0,2%-ного раствора уксусной кислоты при температуре 95°С в течение 30 минут, обезвоживают спиртом и высушивают до образования гранул. Экстракцию протамина серной кислотой из гранул проводят в три этапа:

1 этап - 6%-ный раствор серной кислоты в соотношении объемов 1:1,25;

2 этап - 4%-ный раствор серной кислоты в соотношении объемов 1:0,75;

3 этап - 2%-ный раствор серной кислоты в соотношении объемов 1:0,5.

Затем осаждают белки из экстракта добавлением тройного объема этилового спирта и растворяют осадок в горячей воде. Обрабатывают раствор гидроокисью бария до рН 7,0-7,5, для отделения избытка серной кислоты добавляют аммиак до рН 10,5-11,5 для осаждения сульфата бария и посторонних белков в изоэлектрической точке (далее ИЭТ). Затем отделяют осадок декантацией и центрифугированием. Обрабатывают маточный раствор и центрифугат кизельгуром при нагревании до 80°С, затем фильтруют на нутч-фильтре и проводят фильтрат через катионит в “Н+”-форме для отделения минеральных солей. Элюат концентрируют упариванием под вакуумом или баромембранным методом и осаждают продукт из элюата трехкратным объемом спирта. Выделенный осадок подвергают пяти последовательным переосаждениям с центрифугированием и высушиванием для удаления остаточной влаги. Готовый продукт высушивают при температуре 55-65°С в течение 24 часов.

Изобретение относится к медицине, точнее к производству фармацевтической субстанции протамин сульфата. Способ характеризуется тем, что сырые молоки измельчают, обрабатывают при температуре 0,2%-ным раствором уксусной кислоты, обезвоживают спиртом, высушивают до образования гранул, экстрагируют гранулы раствором серной кислоты в три этапа, осаждают белки из экстракта добавлением тройного объема этилового спирта, растворяют осадок, обрабатывают раствор гидроокисью бария до рН 7,0-7,5, добавляют аммиак до рН 10,5-11,5, отделяют осадок декантацией и центрифугированием, маточный раствор, полученный после декантации и центрифугат обрабатывают кизельгуром при нагревании до 80°С, фильтруют на нутч-фильтре, проводят фильтрат через катионит в “Н+”-форме, концентрируют элюат упариванием под вакуумом или баромемранным методом и осаждают продукт из элюата трехкратным объемом спирта путем пятикратного переосаждения с центрифугированием и высушиванием осадка, для удаления остаточной влаги и готовый продукт высушивают при температуре 55-65°С в течение 24 часов. Технический результат - повышение степени чистоты протамина сульфата путем очистки от сопутствующих посторонних белков и повышение его основной характеристики антигепариновой активности. 1 табл.

Способ производства протамина сульфата из половозрелых молок лососевых пород рыб, характеризующийся тем, что сырые молоки измельчают, обрабатывают при температуре 95°С в течение 30 мин 0,2% раствором уксусной кислоты, обезвоживают спиртом и высушивают до образования гранул, экстрагируют гранулы раствором серной кислоты в три этапа, при этом на первом этапе используют 6%-ный раствор кислоты в соотношении 1:1,25, на втором этапе - 4%-ный раствор серной кислоты в соотношении объемов 1:0,75, на третьем этапе - 2% раствор серной кислоты в соотношении объемов 1:0,5, осаждают белки из экстракта добавлением тройного объема этилового спирта, растворяют осадок в горячей воде, обрабатывают раствор гидроокисью бария до рН 7,0-7,5, добавляют аммиак до рН 10,5-11,5, отделяют осадок декантацией и центрифугированием, маточный раствор, полученный после декантации, и центрифугат обрабатывают кизельгуром при нагревании до 80°С, фильтруют на нутч-фильтре, проводят фильтрат через катионит в “Н⁺”-форме, концентрируют элюат упариванием под вакуумом или баромемранным методом, осаждают продукт из элюата трехкратным объемом спирта путем пятикратного переосаждения с центрифугированием и высушиванием осадка, готовый продукт высушивают при температуре 55-65°С в течение 24 ч.