ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/14 C12P7/48 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается селекции нового штамма гриба Aspergillus niger продуцента лимонной кислоты в условиях глубинного культивирования на средах из сгущенного сока сорго.

В качестве прототипа выбран известный промышленный штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-326 продуцент лимонной кислоты, селекционированный для ферментации мелассных сред. Штамм строго специфичен к условиям ферментации и его использование для нового вида сырья нецелесообразно, поскольку не обеспечивает высоких показателей процесса ферментации (таблица).

Изобретение направлено на получение нового штамма, обладающего высокой активностью биосинтеза лимонной кислоты при ферментации сред из сгущенного сока сорго.

Исходным объектом для получения нового штамма служили светлоокрашенные культуры Aspergillus niger, сохраняемые в коллекции ВHИИПАКК.

Для получения нового высокопродуктивного штамма Aspergillus niger осуществляли ступенчатую селекцию, состоящую из четырех этапов. Для индуцирования мутантов исходные культуры подвергали воздействию УФ лучей, полученные мутанты стабилизировали путем отбора устойчивых спонтанных вариантов.

Наиболее устойчивый и активный мутантный штамм имел темно-бежевую окраску конидий.

При культивировании на средах из сгущенного сока сорго в глубинных условиях за 5-6 сут ферментации новый штамм обеспечивает выход лимонной кислоты от сахара питательной среды 80,1% что значительно превосходит штамм, селекционированный для мелассных сред (таблица). Кроме того, штамм позволяет ферментировать питательные среды из сгущенного сока сорго с концентрацией по сахару, увеличенной до 137 г/дм³ с высокими показателями: съем лимонной кислоты составил 18,0 г/дм³• сут, конверсия сахаров в лимонную кислоту 79,2% что также свидетельствует о существенных преимуществах нового штамма по сравнению со штаммом-прототипом.

Новому селекционированному штамму Aspergillus niger во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов присвоен коллекционный номер ВКПМ F - 719.

Культурально-морфологические свойства штамма Aspergillus niger ВКПМ F-719.

На сусло-агаpе через 5 сут культивирования при 32^oC образует колонии с диаметром 9,4 см. Окраска колоний темно-бежевая. Воздушный мицелий хорошо развит, конидиеношение обильное. В центре колонии конидиальные головки более крупные, образуют небольшое возвышение. Обратная сторона колонии гладкая, белая. Конидиальные головки круглой формы, их диаметр от 62 до 128 мкм. Вздутия конидиеносцев округлые или слегка вытянутые, диаметром 30-34 мкм. Стеригмы двуслойные. Размеры стеригм порядка I от 9,3, до 14,6 мкм, порядка II6,65±0,15 мкм. Средний диаметр конидий 3,9 мкм. Конидиеносцы прямые, бесцветные, длиной от 318 до 1290 мкм, преобладают конидиеносцы длиной 950 мкм.

На среде Чапека через 5 сут культивирования образуются колонии с диаметром 6,5 см. Окраска колоний желтовато-бежевая. Воздушный мицелий хорошо развит, конидиеношение обильное. По краю колонии в радиусе 0,6 см колония имеет белую окраску, обусловленную незрелыми конидиальными головками. Отмечается небольшое количество незрелых конидиальных головок и центре колонии и по всей ее поверхности. Субстратный мицелий -светлый, имеет небольшую радиальную складчатость.

Физиолого-биохимические свойства
Аэроб. Температурный диапазон роста 28-34^oC. Оптимальная температура роста 32^oC. Оптимум pH 6,8 7,2.

Ассимиляция источников углерода: обильный рост на сахарозе, D-глюкозе, фруктозе, D-галактозе, мальтозе, манните, сорбите: лактоза и крахмал не ассимилируются.

Ассимиляция источников азота: штамм усваивает азот органических соединений (белки, пептоны, аминокислоты) и азот минеральных соединений соли аммония, нитраты.

Способ хранения.

Штамм сохраняется в виде высушенных конидий (5-10% остаточной влажности). Температура хранения 16-18^oC.

Генетические особенности: прототроф.

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-719 идентифицирован по определителю грибов рода Aspergillus.

Пример 1. Для лабораторных испытаний посевной материал селекционированного штамма Aspergillus niger ВКПМ F- 719 выращивают в пробирках на сусло-агаре (концентрация сахара 7 градусов по Баллингу, агар-агар-20 г/дм³, pH 5,8).

Через 7 сут выращивания при 32^oC конидии снимают с поверхности среды, подсушивают до остаточной влажности 5-8% и хранят при комнатной температуре.

Подготовка конидий продуцента.

Конидии гриба в количестве 0,3 г на 100 см³ помещают в среду для замачивания следующего состава, г/дм³:
Cахар-песок 50
Дигидрофосфат калия 0,16
Нитрат аммония 2,5
Сульфат магния, гептагидрат 0,25
Суспензию конидий в среде помещают на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают 5-6 ч при 32^oC.

Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия.

36 г концентрированного сока сорго растворяют в 250 см³ горячей воды, автоклавируют 30 мин при 0,075 МПа, охлаждают до 45-50^oC и стерильно вносят 7,5 см³ 10%-ного раствора нитрата аммония, 0,75 см³ 10%-ного раствора сульфата магния гептагидрата и доводят до 300 см³ стерильной водой. Концентрация сахара в среде составляет 50 г/дм³.

Приготовление питательной среды для ферментации.

51 г концентрированного сока сорго растворяют в 250 см³ горячей воды, автоклавируют 30 мин при 0,075 МПа 30 мин, охлаждают до 45-50^oC и стерильно вносят 5 см³ 10%-ного раствора нитрата аммония, 0,75 см³ 10%-ного раствора сульфата магния гептагидрата и доводят объем до 300 см³ стерильной водой. Концентрация сахара в среде составляет 70 г/дм³.

Приготовление питательной среды для подпитки культуры гриба. 48 г концентрированного сока сорго растворяют в 150 см³ горячей воды, автоклавируют при 0,075 МПа 30 мин, охлаждают до 45-50^oC и стерильно вносят 3,4 см³ 10%-ного раствора нитрата аммония. Обьем доводят до 200 см³. Концентрация сахара в среде составляет 100 г/дм³.

Выращивание посевного мицелия.

Колбы емкостью 750 см³, содержащие 50 см³ питательной среды, засевают 10 см³ суспензии конидий. Колбы помещают на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выращивают культуру гриба в течение 40 ч при температуре 32^oC.

Ферментация концентрированного сока сорго.

Колбы емкостью 750 см³, содержащие 50 см³ питательной среды, засевают 5 см³ культуры посевного мицелия. Колбы помещают на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выращивают при 32^oC в течение первых-вторых суток, затем температуру снижают до 28^oC до конца ферментации. Общая продолжительность выращивания составляет 5 сут.

На вторые и третьи сутки проводят подпитку культуры гриба по 14 см³ питательной среды один раз в сутки.

После 5-суточной ферментации культуру гриба инактивируют кипячением в течение 3 мин и определяют количество лимонной кислоты, выход ее от сахара, съем лимонной кислоты с единицы объема среды за сутки процесса ферментации.

Данные представлены в таблице.

Пример 2. Подготовку конидий продуцента, приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия, ферментации, выращивание посевного мицелия, ферментацию проводят аналогично примеру 1.

Приготовление питательной среды для подпитки культуры гриба.

76,9 г концентрированного сока сорго растворяют в 150 см³ горячей воды, автоклавируют при 0,075 МПа 30 мин, охлаждают до 45-50^oC и стерильно вносят 3,4 см³ 10%-ного раствора нитрата аммония и доводят объем до 200 см³. Концентрация сахара в среде составляет 160 г/дм³.

Подпитка культуры гриба.

На вторые-третьи сутки в колбы стерильно вносят по 12,5 см³ питательной среды.

Дальнейшие операции аналогичны примеру 1.

Данные представлены в таблице.

Пример 3. Условия эксперимента аналогичны примеру 1.

В качестве продуцента лимонной кислоты используют известный штамм Aspergillus niger ВКПМ F 326.

Данные представлены в таблице.

Данные, представленные в таблице, показывают, что предлагаемый штамм на среде из сока сорго позволяет достигнуть съема лимонной кислоты 18,7 г/дм³•сут, конверсии сахаров в лимонную кислоту 80,1 в то же время у штамма ВКПМ F-326 в тех же условиях ферментации эти показатели значительно уступают: съем лимонной кислоты 16,32 г/дм³•сут, конверсия сахаров в лимонную кислоту 69,5
Таким образом, селекционированный штамм Aspegillus niger ВКПМ F -719 является активным кислотообразователем на средах из сгущенного сока сорго и обеспечивает высокие показатели при ферментации питательных сред.

Источники информации
1. Заявка N 94041280/13 PФ, МКИ 5, С 12 P 7/48, 1994.

2. Пат. 1345472 СССР, кл С 12 N 1/14, 1987.

3. В.И.Билай, Э.З.Коваль. Асперигиллы. Киев, Hаукова думка, 1988, с.99.

Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: новый штамм гриба, используемый для производства лимонной кислоты в условиях глубинного культивирования. Селекционированный штамм Aspergillus higer ВКПМF -719 обладает высокой активностью образования лимонной кислоты при глубинном культивировании на средах из сгущенного сока сорго, образуя 18,0 - 18,7 г/дм³. сут лимонной кислоты. При этом конверсия сахаров питательной среды в лимонную кислоту составляет 79,2 - 80,1%. 1 табл.

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-719 продуцент лимонной кислоты.