ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/14 C12P7/48 C12P7/48 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и селекции гриба Aspergillus niger продуцента лимонной кислоты для ферментации глубинным способом сред сахарозо-минеральных и приготовленных из гидролизатов крахмала.

Известен мутант IBR 1 для культивирования Aspergillus niger на сахарозо-минеральных средах, ферментирующий питательную среду за 14 дней с выходом от сахара 73-82% [1]
Недостатком этого штамма является сравнительно невысокий выход лимонной кислоты при большой длительности ферментации.

Изобретение направлено на получение штамма, образующего светлоокрашенные конидии обладающего устойчивой активностью кислотообразования при длительном хранении штамма и высоким выходом лимонной кислоты от сахара при ферментации сахарозо-минеральных сред и сред, приготовленных из гидролизатов крахмала.

Новый штамм селекционирован из черноокрашенных штаммов Aspergillus niger, сохраняемых в коллекции ВНИИ ПАКК. При различных дозах ультрафиолетового облучения из культуры музейного штамма селекционировано 55 цветных мутантов, имеющих коричневую, бежевую, кремовую окраску конидий.

Из них наиболее устойчивой и высокой активностью отличался штамм, имеющий кремовую окраску конидий и светло-бежевую поверхность колонии.

При культивировании на сахарозо-минеральной среде в глубинных условиях новый штамм образует лимонную кислоту с выходом из затраченного сахара 87,6-90% что значительно превосходит прототип штамм ВКП MF-501 (табл.1). При ферментации гидролизатов крахмала выход от сахара у нового штамма достаточно высокий и составляет 82,8%
Существенное преимущество нового штамма стабильно устойчивое кислообразование при его длительном хранении. По сравнению с прототипом новый светлоокрашенный штамм сохраняет постоянно высокую продуцирующую активность - через 12 месяцев хранения конидий выход лимонной кислоты при ферментации сахарозо-минеральной среды составляет 88,7% на 1 дм³/сутки образуется 23,7 г лимонной кислоты. В то же время прототип ВКПMF-501 за 12 месяцев хранения снижает выход лимонной кислоты от сахара от 82% до 65,25% образование лимонной кислоты на 1 дм³/сут уменьшается от 21,9 г до 17,4 г.

Новому селекционированному штамму Aspergillus niger во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов присвоен коллекционный номер ВКПMF-696.

Культурально-морфологические свойства нового штамма Aspergillus niger ВКПMF-696 заключаются в следующем.

На 5 сутки роста на сусло-агаре при 32^oC гигантская колония диаметром 90 мм. Окраска колонии светло-бежевая. Центр колонии приподнятый. В радиусе 10 мм конидиеношение обильное, на остальной части колонии конидиальные головки образуются группами, не очень плотно. "Стерильный" край с незрелыми конидиальными головками составляет около 10 мм в радиусе. Через 7 суток конидии созревают на всей поверхности колонии. С подошвы в центре колонии мицелий плотный, остальная часть мицелия тонкая.

После 10 суток выращивания конидиальные головки диаметром 64-225 мкм, в среднем 119 мкм. Стеригмы первого слоя 12,5 мкм (по мере старения увеличиваются в размере, приобретая форму пузырька); стеригмы второго слоя - 6,8 мкм.

Конидии округлые с кремовой оболочкой, средний диаметр конидий 3,8 мкм. Конидиеносцы прямые, их длина колеблется от 270 мкм до 1800 мкм, в среднем составляет 870 мкм. Ширина сечения конидиеносца от 9 до 18 мкм, в среднем 13,5 мкм. Конидиеносцы неокрашенные.

От известного бежевого штамма BKPMF-501 новый штамм отличается более крупными конидиями ( у штамма ВКРМ -501 диаметр конидий 3,4 мкм) и светло-бежевый их окраской.

Штамм ВКРМ -696 идентифицирован по определению грибов рода Aspergillus [2]
Физиолого-биохимические свойства
Штамма Aspergillus niger BKPMF-696
Аэроб, температура культивирования 28-32^oC, pH -5,5.

Отношение к источникам углерода: усваивает глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, в меньшей степени маннит, галактозу, сорбит.

Отношение к источникам азота: усваивает азот органических соединений, например белок, пептон, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мочевину, усваивает соли аммония, нитраты.

Генетическая особенность штамма прототроф.

Способ сохранения. Новый штамм хранится в виде воздушно-сухих конидий, отделенных от культуры гриба, выращенной на сусло-агаре в течение 10 суток ( 6 7 суток при 32^oC и 3 4 суток при комнатной температуре). Хранение конидий при постоянной комнатной температуре, относительная влажность воздуха, не превышающая 75% предохраняются от воздействия прямых солнечных лучей.

Пример 1. Для лабораторных испытаний посевной материал выращивают в пробирках на сусл0-агаре; для полупроизводственных испытаний посевной материал выращивают в кюветах на плотной питательной среде, приготовленной на основе пивного неохмеленного сусла, содержащего 7% сухих веществ и уплотненной агар-агаром (20 г/дм³),pH среды 5,8.

Высота слоя среды 12 13 мм. Стерильную среду засевают конидиями культуры гриба и выдерживают в термостате при 32^oC в течение 7 суток. Относительная влажность воздуха в термостате постепенно снижается: первые четверо суток 80% 60% последние трое суток 60% 40% Для полного созревания и подсушивания пробирочную культуру гриба выдерживают при комнатной температуре в течение 2-х суток. Через 7 суток конидии снимают с поверхности грибных пленок в кюветах при помощи специального вакуумного устройства. Влажные конидии подсушивают до остаточной влажности 5-8%
Хранят при комнатной температуре.

Процесс ферментации в лабораторных условиях проводят глубинным способом на качалке АВУ 50p с числом качаний 160-180 в 1 мин. Температура воздуха в качалочной комнате 32^oC. Питательные среды приготавливают в колбах емкостью 750 см³; объем среды 50 см³
Культурой гриба, выращенной на сусло-агаре в течение 10 суток, или воздушно-сухими конидиями (10⁷ конидий/см³ среды) засевают питательную среду и в течение двух суток выращивают посевной мицелий. Основным сырьем для приготовлении сред в данном примере является сахарный песок.

Состав среды для получения посевного мицелия (г/дм³): сахар 50, нитрат аммония 2,5, сульфат магния семиводный 0,25, дигидрофосфат калия 0,16, свекловичная меласса 17 (для стимуляции роста), водопроводная вода до 1 дм³, pH 5,0 5,5. Подросшим мицелием в количестве 10 см³ засевают 50 см³ ферментационной среды.

Состав ферментационный среды отличается от состава питательной среды увеличенным до 150 г/дм³ содержанием сахара. Всего на выращивание посевного мицелия и ферментацию затрачивается 8,0 г сахара. Среды стерилизуются в автоклаве текучим паром 15 мин и при 0,05 мПа 30 мин.

За 5 суток ферментации у штамма BKPMF- 696 образовалось 7,01 г лимонной кислоты, съем лимонной кислоты составил 23,4 г/(дм³•сутки); выход лимонной кислоты от введенного сахара 87,6% продуктивность биомассы 15,2 г лимонной кислоты на 1 г воздушно-сухой биомассы. У известного штамма BKPMF-501 (контроль опыта) эти показатели значительно уступают (табл. 1).

Пример 2. Посевной материал нового штамма заготавливается по способу, описанному в примере 1. Сырьем для приготовления питательной и ферментационной сред является гидролизат крахмала с содержанием глюкозы 74,9% Посевной материал гриба выращивается на качалке АВУ 50p в течение двух суток на среде состава, г/дм³: гидролизат крахмала 67; нитрат аммония 2,5; дигидрофосфат калия 0,16; сульфат магния семиводный 0,25; цинк сернокислый 0,005; вода водопроводная до 1 дм³.

Посевной мицелий в количестве 10 см³ вносят в ферментационную среду состава, г/дм³: гидролизат крахмала 94; нитрат аммония 1,6; дигидрофосфат калия 0,16; сульфат магния семиводный 0,25; цинк сернокислый 0,005. Исходный объем ферментационной среды 50 мл. Через двое суток в ферментационную среду добавляют в два приема концентрацией 250 г сахара на 1 дм³ раствор гидролиза крахмала в количестве 24 см³.

Общий расход сахара на колбу 10 г. Питательную и ферментационную среды стерилизуют в автоклаве 15 мин текучим паром и 20 мин при 0,05 мПа. Через 6 суток процесса ферментации у штамма BKPMF-696 образуется 8,28 г лимонной кислоты, при этом съем лимонной кислоты составляет 23,0 г/(дм³ •сутки); выход лимонной кислоты от затраченного сахара 82,8% продуктивность биомассы 15,3 г лимонной кислоты на 1 г воздушно-сухой биомассы.

Известный штамм ВКРМ -501 значительно уступает новому штамму по всем показателям, особенно по выходу лимонной кислоты на единицу воздушно-сухой биомассы (10,4).

Пример 3. Для определения устойчивости свойств штаммов BKPMF-501 и BKPMF-696 проводились испытания активности у сохраняемого посевного материала (спор гриба). Проверялась активность исходного посевного материала, полученного при размножении элитных культур, активность посевного материала после 6 и 12 месяцев хранения в лабораторных условиях при 20±1^oC и относительной влажности 75%
Основное сырье для приготовления ферментационных сред сахарный песок. Состав сред изложен в примере 1. Содержание сахара в среде 150 г/дм³; на одну колбу расходуется 8 г сахарного песка.

Результаты сравнительных испытаний посевного материала двух штаммов представлены в табл.2.

Активность исходного посевного материала двух штаммов сравнительно мало отличается за исключением продуктивности мицелия у штамма BKPMF-696 продуктивность мицелия (выход лимонной кислоты на 1 г воздушно-сухого мицелия) в 1,5 раза больше, чем у штамма BKPMF-501.

После 6 месяцев хранения показатели активности штамма BKPMF-696 остаются на высоком уровне конверсия сахара в лимонную кислоту 90% съем лимонной кислоты с 1 дм³/сут. составляет 24,0 г у сравниваемого штамма BKPMF-501 в течение 6 месяцев хранения выход лимонной кислоты от сахара снижается от 82% до 70% съем лимонной кислоты от 21,9 г до 18,7 г.

В последующие 6 месяцев хранения у посевного материала штамма BKPMF-696 показатели активности не изменяются.

У сравниваемого штамма BKPMF-501 наблюдается дальнейшее ухудшение показателей конверсия сахара после 12 месяцев хранения составляет 65,25% съем лимонной кислоты снижается до 17,4 г на 1 дм³/сутки.

Таким образом, новый селекционированный нами штамм Aspergillus niger BKPMF-696, образующий светлоокрашенные конидии, существенно отличается от известных штаммов высоким выходом лимонной кислоты от сахара, устойчивостью выхода лимонной кислоты и активности кислотообразования при длительном хранении.

Штамм является конкурентоспособным продуцентом лимонной кислоты при ферментации глюкозо-минеральных и сахарозо-минеральных сред.

Использование: биотехнология, производство лимонной кислоты. Сущность изобретения: новый штамм Aspergillus niger ВКПMF-696-продуцент лимонной кислоты, получен в процессе селекции из штамма, хранящегося в музее ВНИИ ПАКК. Штамм ВКПM -696 образует округлые, кремовой окраски конидии, средний диаметр конидий 3,8 мкм, стеригмы двухслойные длиной 12,5 мкм и 6,8 мкм. Активно ферментирует сахарозо-минеральные питательные среды и среды, полученные в результате гидролиза крахмала. Обладает устойчивой активностью кислотнообразования и стабильно высоким (82,2-90%) выходом лимонной кислоты от сахара в течение 12 месяцев хранения штамма. 2 табл.

Штамм гриба Aspergillus niger BKПF 696 продуцент лимонной кислоты.