СПОСОБ ОТБОРА ШТАММА ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2003 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12P7/48 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам отбора активных штаммов гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты.

Известен способ, в котором для получения лимонной кислоты культивированием дрожжей, плесневого гриба Penicillium или бактерий на углеводородной среде в присутствии минеральных солей отбирают УФ-мутанты, чувствительные к ингибитору их роста монофторацетату или монофторцитрату. Так, чувствительный к фторацетату мутантный штамм Р-72 дрожжей Candida lipolytica даст выход лимонной кислоты до 78 мг/л, а исходный штамм только 42 мг/л /1/.

Таким способом - по чувствительности мутантного штамма микроорганизма к ингибитору роста - быстро отбирают активный штамм - продуцент лимонной кислоты. В работе отсутствуют сведения относительно способа отбора мутанта Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты для ферментации углеводсодержащих сред.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ отбора мутантных штаммов плесневого гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты для ферментации углеводсодержащих сред в присутствии минеральных солей, включающий посев УФ-облученных конидий на сусло-агар в 200 чашек Петри, выращивание колоний, отбор конидий из морфологически измененных колоний, выращивание культур, определение их кислотообразующей активности биоконверсией углеводсодержащей среды /2/. Процесс первичного отбора проводится после каждой дозы УФ-облучения культуры гриба, повторяется многократно и требует больших затрат времени и труда, пока не будет найден активный мутантный штамм гриба.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является уменьшение затрат времени и труда на первичный отбор активного кислотообразующего штамма гриба Aspergillus niger.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что в способе отбора штамма гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты, включающем посев конидий культуры гриба на агаризованную питательную среду, выращивание на питательной среде колоний в течение 4-6 суток, отбор конидий из колоний, имеющих измененную структуру, последующее определение кислотообразующей активности штамма гриба биоконверсией углеводсодержащей среды, засевают конидии культуры гриба, подвергнутой мутагенезу и/или гибридизации и/или рекомбинации, на питательную среду, в которую предварительно добавляют транс-аконитовую кислоту в количестве (5,0 - 9,0)•10^-3 г/см³ среды, при выращивании отмечают на 1,5-2 сутки расположение колоний, в 2-3 раза меньших по диаметру, из которых после выращивания отбирают конидии гриба для последующего определения активности штамма гриба.

Сведения о возможности осуществления изобретения и достижении технического результата представлены в примерах.

В примерах использована транс-аконитовая кислота, С₆Н₆О₆, м.в. 174, в виде раствора, который приготовлен из 0,174 г кислоты растворением в 5 см³ дистиллированной воды.

В качестве объектов предлагаемого способа испытаны мутанты гриба Aspergillus niger, уже известные активные продуценты лимонной кислоты штаммы Л-1, ВКПМ F-326, ВКПМ F-681 /4, 5, 6/, а также испытаны опытные штаммы рекомбинантов митотических и гетерозиготных диплоидов гриба и природный штамм 82.

Активные продуценты лимонной кислоты - штаммы Л-1, ВКПМ F-326, ВКПМ F-681, подвергнутые отбору ранее известным способом (по прототипу), стали объектом контроля предлагаемого способа.

Кислотообразующая активность штаммов гриба определялась биоконверсией мелассной и сахарозоминеральной сред /3/.

Пример 1
0,5 см³ раствора транс-аконитовой кислоты вносят в 10 см³ расплавленного сусло-агара в 4-6 чашках Петри. Таким образом, в 1 см³ расплавленной питательной среды содержится 9,0•10^-3 г транс-аконитовой кислоты.

Конидии штамма Л-1 гриба Aspergillus niger фильтруют через стерильный фильтр и разбавляют стерильной водой до 1•10⁶ конидий в 1 см³, что соответствует 4 конидиям в 1 большом квадрате камеры Горяева. 0,5-1,0 см³ разбавленной в 10⁴ раз суспензии конидий распределяют по поверхности питательной среды в чашках Петри.

Колонии культуры гриба выращивают при температуре 32^oС в течение 1,5-2 суток и затем отмечают расположение тех колоний, диаметр которых в 2-3 раза меньше, чем у остальных. Через 5 суток выращивания из отмеченных колоний отсеивают конидии, которые затем проращивают на сусло-агаре для определения кислотообразующей активности штамма биоконверсией углеводсодержащей среды в лимонную кислоту.

Данные и результаты опыта представлены в таблице.

Пример 2
В примере использован штамм ВКПМ F-326 и доза транс-аконитовой кислоты 7,0•10^-3 г/см³ на среде Чапека, остальные условия аналогичны примеру 1.

Пример 3
В примере использован штамм ВКПМ F-681 и доза транс-аконитовой кислоты 6,0•10^-3 г/см³, другие условия аналогичны примеру 1.

Примеры 4-7
Примеры аналогичны примеру 1, но отличались штаммом гриба и дозой транс-аконитовой кислоты.

Результаты опытов представлены в таблице.

Анализ данных, представленных в таблице, показывает, что по сравнению с известным в предлагаемом способе уменьшается количество испытуемых культур до 100 и менее, так как для проверки активности кислотообразования отбираются культуры, чувствительные к действию транс-аконитовой кислоты, то есть образующие колонии небольшой величины и конидии из таких колоний имеют высокую кислотообразующую активность.

Если культура гриба не чувствительна к транс-аконитовой кислоте, то есть образует колонии обычного для штаммов гриба диаметра, то кислотообразующая активность таких штаммов невысока, как в примерах 4, 7.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить объем работы, то есть временные и трудовые затраты при первичном отборе активных штаммов гриба Aspergillus niger - продуцентов лимонной кислоты.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. А. А. Имшенецкий, Е.Я. Щербакова "О корреляции, существующей между морфологическими и физиологическими изменениями у мутантов Aspergillus niger" //Микробиология// - 1964, - 31, - вып. 2, с. 252-256.

2. Патент США 3801455, НКИ 195/28R, МКИ С 12 b, 1974.

3. Инструкция по биологическому и химическому контролю производства пищевой лимонной кислоты, С-Петербург, 1997, с. 109-122.

4. Авторское свидетельство СССР 407946, МКИ С 12 К 3/00, 1974.

5. Патент РФ 1315472, МКИ С 12 N 1/14, 1987.

6. Патент РФ 2089615, МПК 6 С 12 Р 7/48, 1997.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к отбору активных штаммов - продуцентов лимонной кислоты. Активные штаммы отбирают в процессе засева конидий культуры гриба Asp. niger, подвергнутой мутагенезу, и/или гибридизации, и/или рекомбинации, на агаризованную питательную среду с содержанием трансаконитовой кислоты в количестве (5,0-9,0)•10³ г/см³ среды. Выращивают посевы в течение 4-6 суток, при этом на 1,5-2 сутки отмечают расположение колоний, в 2-3 раза меньших по диаметру. После завершения выращивания из этих колоний отбирают конидии гриба и определяют его кислотообразующую активность. Способ позволяет упростить и ускорить отбор. 1 табл.

Способ отбора штамма гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты, включающий посев конидий культуры гриба на агаризованную питательную среду, выращивание на питательной среде колоний в течение 4-6 суток, отбор конидий из колоний, имеющих измененную структуру, последующее определение кислотообразующей активности штамма гриба биоконверсией углеводсодержащей среды, отличающийся тем, что засевают конидии культуры гриба, подвергнутой мутагенезу, и/или гибридизации, и/или рекомбинации, на питательную среду, в которую предварительно добавляют трансаконитовую кислоту в количестве (5,0-9,0)•10^-3 г/см³ среды, при выращивании отмечают на 1,5-2 сутки расположение колоний, в 2-3 раза меньших по диаметру, из которых после выращивания отбирают конидии гриба для последующего определения активности штамма гриба.