Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм аммоNIаGеNеS продуцент тимина Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12P17/12 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается микробиологического синтеза тимина - пиримидиного азотистого основания, применяемого как сырье для синтеза лекарственных препаратов анти- концерогенного и антивирусного действия.

Микробиологический способ производства тимина путем прямой ферментации не известен. Сведения о штаммах-продуцентах отсутствуют.

Целью изобретения является новый штамм бактерий Corynebacterlum (Brevlbacterlum) ammoniagenes - продуцент тимина.

ШтаммСогупеЬасгеНит (Brevlbacterlum) ammoniadenes NG-13 получен генетико-селекционным путем с использованием мутагенов (нитрозогуанидин, метилметансульфонат. диэпоксиоктан) и аналогов пиримидинов. Исходным материалом для селекции послужил типовой штамм Brevlbacterlum ammoniagenes ATCC 6872.

Штамм-продуцент тимина Corynebacterium ammoniagenes NG-13 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-4765.

Культураяьно-морфологические признаки.

Грамположительная палочка длиной 1,5-2,0 мкм, шириной 0,6-1,0 мкм без жгутиков, неподвижная, не образует спор. На полноценной агаризованной среде (L-arap. мясопептонный бульон Хоттингера) через 3-4 сут инкубации при 28-34°С образует круглые колонии диаметром 1,0-1.5 мм с ровными краями, бледно-желтого цвета. Поверхность колоний гладкая, с матовым блеском и слабой концентрической исчер- ченностью. на 2-3-е сутки инкубации колонии выделяют в среду красно-бурый пигмент. Облигатный аэроб. При инкубации в полноценной жидкой среде без встряхивания при 34°С рост отсутствует, при интенсивной аэрации наблюдается обильный

О

о о о

рост. Без встряхивания суспензия бактерий флокулирует, образуя осадок бледно-желтого цвета. Для роста на жидкой и агаризован- ной синтетической среде клетки продуцента требуют витаминов Bi, Вз и биотина, а так- же аденина и L-аргинина.

Микроорганизм поддерживают на косяках с плотной питательной средой (L-arap, мясо-пептонный агар или агар Хоттингера). Выращивают его на синтетической солевой среде следующего состава, г/л:

Глюкоза20,0

Мочевина (стерилизуется отдельно)2,0

(NH4)2SO43,0

КН2Р041,0

К2НР043,0

MgS04 7Н200,3

Аденин0,001

CaCIa -2Н200,01

FeS04 7Н200,01

MnCl2 4Н2О0,0026

Тиамин0,005

Пантотенат кальция0,01

Биотин0,00003

L-Аргинин0,001

Дистиллированная вода (рН 7,3)До 1л

На основе указанной среды готовят плотную, добавляя 20 г/л агара. С макси- мальной скоростью продуцент растет как на полноценной, так и на синтетической солевой среде прк 34°С и рН 7,0-7,3.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм NG-13 является ауксотрофом по аденину и брадитрофом по аргинину. В качестве источника аденина может использоваться также аденозин, в меньшей степени, адениловые нуклеотиды. Желатину не разжижает, на крахмальном агаре и на обезжи- ренном молоке роста нет. Клетчатку не разрушает и не усваивает, нитраты не восстанавливает. Усваивает глюкозу, фруктозу, рибозу, цитрат, пуриновые и пиримидино- вые рибонуклеозиды, плохо усваивает са- харозу, сорбит, маннит, не потребляет лактозу, галактозу, фумарат, сукцинат, де- зоксирибозу, ксилозу, арабинозу. Устойчив к бактериостатическому действию 5-фтору- рацила, 5-фторуридина, азаурацила, азау- ридина и 5-фтордезоксиридина. Содержит мутацию по нуклеотиддифосфатредуктазе, приводящую к сверхпродукции тимина. Антагонистических свойств нет, не патогенен. За 120 ч ферментации образует 3-4 г/л тимина,

Пример 1. Посевную среду инокули- руют бактериями, выращенными на полноценной агаризованной среде в течение

24-28 ч. Посевной материал получают выращиванием в колбах обьемом 750 мл, содержащих 75 мл среды, помещенных на термостатируемую круговую качалку (200- 240 об/мин) при 30-34°С в течение 24 ч. Состав посевной среды, г/л:

Глюкоза20,0

Пептон10,0

Дрожжевой экстракт10,0

NaCI2,0

Водопроводная вода (рН 7,0-7,3)До 1 л

Затем в колбу объемом 750 мл, содержащую 30 мл ферментационной среды, вносят 5-10% посевного материала и инкубируют на круговой качалке (300-400 об/мин) при 34°С. Ферментацию проводят в синтетической солевой среде следующего состава, г/л:

КН2Р0410,0

К2НР0410,0

MgS04 7Н2010,0

Пантотенат кальция0,01

Аденин0,02

Глюкоза100,0

Мочевина (стерилизуется отдельно)6,0

Тимамин0,005

Биотин0,003

Аргинин0,02

Микроэлементы (при использовании водопроводной воды микроэлементы не добавляют):

СаСЬ 2Н200,1

ZnSCM 7Н200,001

FeS04 7Н200,01

MnCl2 4Н200,036

Дистиллированная вода (рН 7,3-7,4).До 1 л

Спустя 120 ч культуральная жидкость содержит 3,0 г/л тимина.

Пример 2. Условия выращивания посевного материала и проведения ферментации такие же, как и в примере 1, за исклю- чением того, что для ферментации используют обогащенную среду с кукурузным экстрактом. Состав обогащенной ферментационной среды следующий, г/л: КН2Р0410,0

К2НРО410,0

MgS04 7Н2010.0

Кукурузный экстракт40.0

Глюкоза100,0

Мочевина (стерилизуется отдельно)6,0

Водопроводная вода (рН 7.5-8,0, доводят 5n. NaOH)До 1 л.

После ферментации в течение 120 ч культуральная жидкость содержит 4 г/л ти- мина.

Содержание тимина в культуральной жидкости определяют с помощью бумажной хроматографии в системе растворителей: н- бутанол:ледяная уксусная кислота:вода (2:1:1).

Качественный анализ основания проводят несколькими способами: путем тонкослойной хроматографии на силикагелевых пластинках в трех системах растворителей: н-бутанол: ледяная уксусная кислота:вода (2:1:1), н-бутанол:муравьиная кислота:вода (77:10:13) и изомасляная кислота:амми- ак:вода (66:1,5:33); путем жидкостной хроматографии на колонке Lichorosorb RP 8 с обращеннофазным носителем С-8 (хроматограф фирмы Gllson, Франция); путем определения УФ-спектров поглощения (рН 2,0 7,0 и 11,0 в диапазоне длин волн от 200 до 300 нм) элюатов из соответствующего тимину пятна, вырезанного из бумажных

хроматограмм; биологическим способом путем добавления элюата из соответствующего тимину пятна, вырезанного из бумажной хроматограммы, к клеткам тимин - зависимого мутанта Escherlchfa coli К-12: элюэт

поддерживает рост этого мутанта.

С помощью перечисленных методов установлено, что вещество, накапливающееся в культуральной жидкости после культивирования штамма NG-13, аутентично стандартному препарату тиминэ фирмы Sigma. Формула изобретения Штамм бактерий Corynebacterlum ammonlagenes ВКПМ В-4765 - продуцент тимина.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается микробиологического синтеза тимина. Цель изобретения - получение нового штамма бактерий, продуцирующего тимин. Предлагается штамм Corynebacterium (Вrevibacterium) ammoniagenes МС-13(регистрационный номер ВКПМ В-4765), полученный из типового штамма Вrevibacterium ammoniagenes ATCC6872 генетико-селекционным путем. За 120 ч ферментации производит 3-4 г/л тимина.