СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1999 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается технологии пищевых органических кислот, а именно лимонной кислоты, методом глубинной ферментации.

В настоящее время наиболее распространенным видом отечественного сырья для производства лимонной кислоты является меласса. В связи с сезонным характером подготовки данного вида сырья, а также недостаточным уровнем экологической чистоты процесса при получении лимонной кислоты на данном сырье, возникает задача замены мелассы другими видами сырьевых материалов, пригодными для ферментации их в глубинных условиях. Одним из таких видов сырья, удовлетворяющих указанным требованиям является крахмал, который с целью получения лимонной кислоты подвергают гидролизу с последующей ферментацией с помощью гриба-кислотообразователя Аspergillus niger.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ получения лимонной кислоты с использованием питательной среды, содержащей крахмал, заключающийся в том, что 15%-ную суспензию крахмала сначала подвергают гидролизу при помощи α-амилазы в количестве 0,3% к массе сухих веществ крахмала при 70^oC в течение 45 мин для получения гидролиза с декстрозным эквивалентом DE≤10, добавляют минеральные соли при pH 3,0, стерилизуют под давлением 0,98•10⁵ Pa, добавляют метанол к количестве 2,0 об.%, после чего смесь ферментируют с помощью гриба Aspergillus niger с получением целевого продукта.

В данном способе, также как и в других указанных методах в качестве исходного сырья используется сухой крахмал, который суспендируется, затем подвергается гидролизу. Сухой крахмал относится к сравнительно дорогостоящим сырьевым материалам и его применение в указанных способах снижает их экономическую эффективность, и, следовательно, является их недостатком. Кроме того, указанная технология не позволяет добиться экологической чистоты процесса в связи с использованием метанола.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение выхода лимонной кислоты, снижение ресурсозатрат на подготовку гидролизата крахмала, расширение сырьевой базы и создание экологически чистой технологии лимонной кислоты.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения лимонной кислоты на основе питательной среды, содержащей гидролизат крахмала и минеральные соли, включающем гидролиз крахмальной суспензии ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию питательной среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger, приводят гидролиз крахмальной суспензии, содержащей 26 - 36 мас.% сухих веществ, ферментным препаратом бактериальной α-амилазы, взятом в количестве 0,5 - 1,5 единиц амилолитической способности на 1 г сухого вещества крахмала, а перед добавлением минеральных солей выдерживают крахмальную суспензию под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 30 мин.

В качестве исходного крахмалосодержащего сырья, подвергаемого гидролизу, используют очищенную крахмальную суспензию - полупродукт производства крахмала с концентрацией сухих веществ 36 мас.% или сухой крахмал с содержанием 88 мас. % сухих веществ, а в качестве ферментного препарата бактериальной α-амилазы используют препарат, 1 г которого имеет амилолитическую способность (А.С.) 1000 единиц.

Способ иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.

а) Подготовка конидий продуцента
Конидии гриба - продуцента Asp. niger взвешивают в стерильную пробирку из расчета 400 мг на 100 см³, помещают в среду для замачивания конидий следующего состава, г на 1 дм³:
Сахар-песок - 50
Дигидрофосфат калия - 0,16
Нитрат аммония - 2,5
Сульфат магния гептагидрат - 0,25
Суспензию конидий в колбе ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают 5 - 6 часов при температуре 32^oС.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия
12,4 г сухого крахмала растворяют в нагретой до 50^oC водопроводной воде и доводят объем до 200 см³, получая 5 мас.%-ную крахмальную суспензию (в расчете на сухое вещество крахмала), при интенсивном перемешивании нагревают крахмальную суспензию до 60^oC и вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве 0,3 см³, которое соответствует 0,05 мас.% препарата к массе сухого вещества крахмала или 0,5 единицам А. С. /г сухого вещества крахмала, при постоянном перемешивании в течение 45 мин, доводят температуру до 85^oC и выдерживают в этом режиме 90 мин.

Затем гидролизат крахмала выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 45 - 50^oC и стерильно вносят 5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 0,5 см³ раствора сульфата магния гептогидрата концентрации 10 мас.%, 0,32 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%.

в) Приготовление питательной среды для ферментации 90 г сухого крахмала растворяют в водопроводной воде, нагретой до 50^oC. доводят объем до 300 см³, получая 26 мас.%-ную крахмальную суспензию (в расчете на сухое вещество крахмала), которую нагревают при интенсивном перемешивании до 60^oC и вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве 1,95 см³, что соответствует 0,05 мас.% препарата к массе сухого вещества крахмала или 0,5 единиц А.С./г сухого вещества крахмала, при постоянном перемешивании в течение 45 мин, доводят температуру до 85^oC и выдерживают при этой температуре 90 мин. Для прекращения действия ферментного препарата гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20^oC и доводят объем до 500 см³.

Затем гидролизат крахмала выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 45 - 50^oC и стерильно вносят 12,5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 1,25 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 мас.%, 0,8 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас. %, и стерильно разбавляют водой до концентрации ферментированного сахара 150±10 г/дм³.

г) Выращивание посевного мицелия
В колбы емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают 10 см³ суспензии конидий. Колбы ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 48 час при температуре 32^oC.

д) Ферментация питательной среды на основе гидролизата крахмала в лимонную кислоту
В колбы емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают ее 10 см³ подрощенного мицелия. Колбы ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 6 суток при температуре 32^oC. После ферментации культуру гриба инактивируют кипячением и определяют технико-экономические показатели процесса.

Данные сведены в таблицу.

Пример 2.

а) Подготовку конидий продуцента, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примера 1.

Для приготовления питательной среды используют очищенную крахмальную суспензию, содержащую 36 мас.% сухих веществ крахмала.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия
32 см³ очищенной крахмальной суспензии - полупродукта производства крахмала доводят водопроводной водой до объема 200 см³, получая 5,8 мас.%-ную крахмальную суспензию. Дальнейшие операции проводят согласно примеру 1.

в) Приготовление питательной среды для ферментации 250 см³ очищенной крахмальной суспензии - полупродукта производства крахмала нагревают до 60^oC при интенсивном перемешивании вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве 2,25 см³, что соответствует 0,05 мас. % препарата к массе сухого вещества крахмала или 0,5 единицам А.С./г сухого вещества крахмала. Дальнейшие операции согласно примера 1.

Данные сведены в таблицу.

Пример 3.

а) Подготовку конидий продуцента, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примера 1.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия
12,0 г сухого крахмала растворяют в нагретой до 50^oC водопроводной воде и доводят объем до 200 см³, получая 5,0 мас.%-ную крахмальную суспензию, при интенсивном перемешивании нагревают крахмальную суспензию до 60^oC и вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве 0,8 см³, что соответствует 0,15 мас.% препарата к массе сухого вещества крахмала или 1,5 единицы А.С./г сухого вещества крахмала.

Дальнейшие операции проводят аналогично примера 1.

в) Приготовление питательной среды для ферментации 90 г сухого крахмала растворяют в водопроводной воде, нагретой до 50^oC, доводят объем до 300 см³, получая 26 мас. %-ную крахмальную суспензию, при интенсивном перемешивании нагревают до 60^oC вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве 6,0 см³, что соответствует 0,15 мас.% препарата к массе сухого вещества крахмала или 1,5 единицам А.С./г сухого вещества крахмала.

Дальнейшие операции проводят аналогично примера 1.

Пример 4 (по прототипу)
а) Подготовка конидий продуцента, применяемого в примерах 1 - 3 аналогично примера 1.

б) Приготовление гидролизата крахмала
150 г сухого крахмала растворяют в нагретой до 50^oC водопроводной воде и доводят объем до 1000 см³, при интенсивном перемешивании вводят 0,3% к массе сухих веществ крахмала ферментный препарат бактериальной α-амилазы с активностью 1000 ед. /г, что составляет 3,45 ед. А.С. на 1 г сухого вещества крахмала. Затем смесь нагревают до 70^oC и выдерживают при перемешивании 45 мин.

Далее гидролизат нагревают до кипения и кипятят 10 мин для инактивации фермента.

в) Приготовление питательной среды для ферментации
Гидролизат охлаждают до температуры 30^oC, доводят 2 н раствором серной кислоты значение величины pH до 3,0 и добавляют минеральные соли нитрат аммония - 1,5 г/дм³, дигидрофасфат калия - 0,15 г/см³, сульфат магния гептагидрат - 0,2 г/дм³, ионы железа трехвалентного - 0,005 г/дм³, затем питательный раствор выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.

После охлаждения питательную среду вносят 2,0 об.% метанола и смесь ферментируют аналогично примера 1.

Технический результат опытов, представленный в примерах 1 - 3 таблицы, по сравнению с прототипом состоит в увеличении выхода лимонной кислоты до 81,6 - 87,2 мас.% и получен благодаря благоприятным условиям гидролиза крахмальной суспензии при температуре 85^oC, избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, меньшей дозе ферментативного препарата α-амилазы, равной 0,5 - 1,5 единиц А.С./г сухого вещества крахмала.

Увеличение дозы препарата α-амилазы выше 1,5 единиц А.С./г сухого вещества для гидролиза крахмальной суспензии не позволит получить увеличение выхода лимонной кислоты по сравнению с достигнутым в примере 3.

Уменьшение дозы препарата α-амилазы меньше, чем 0,5 единиц А.С./г сухого вещества крахмала для гидролиза крахмальной суспензии, содержащей 36 мас.% сухих веществ, также не позволит получить достигнутый выход лимонной кислоты, как в примерах 1 - 3.

Увеличение концентрации сухих веществ крахмала в суспензии выше 36 мас.% приводит к затрудненному перемешиванию при гидролизе, ухудшению условий гидролиза и снижению технического результата.

Другой технический результат предлагаемого изобретения, а именно: снижение ресурсозатрат на подготовку стадии гидролиза, достигнут по сравнению с прототипом благодаря использованию для гидролиза крахмальной суспензии, содержащей 26 - 36 мас.% сухих веществ крахмала. В этом случае для подготовки стадии гидролиза требуются той же емкости аппараты и те же трудовые ресурсы, что и по известному способу, но увеличивается в 1,7 - 2,5 раза количество сухого вещества крахмала, которое перерабатывается за один технологический цикл.

Уменьшение концентрации сухих веществ крахмала в суспензии меньше 26 мас. % приводит к нежелательному увеличению ресурсозатрат на подготовку стадии гидролиза.

Применение данного способа является более предпочтительным и с экологической точки зрения, так как неиспользование метанола повышает экологическую чистоту процесса в целом, что также является существенным преимуществом.

Предлагаемый способ получения лимонной кислоты в качестве исходного сырья распространяется как на 25 мас.%-ную по сухим веществам крахмальную суспензию, так и на очищенную крахмальную суспензию - полупродукт крахмально-паточного производства, что ведет к расширению сырьевой базы производства лимонной кислоты и в то же время является более эффективным по сравнению с использованием сухого крахмала, как, например, в известном способе, так как относится к более дешевому сырью и не требует дополнительной стадии подготовки суспензии крахмала. Вместе с этим появляется возможность организации цеха лимонной кислоты непосредственно при производстве крахмалопродуктов, что значительно упростит и удешевит процесс получения лимонной кислоты за счет отсутствия проблем, связанных с транспортировкой сырья.

Список литературы
1. Патент N 125986 Польши, МКИ 3 С 12 Р 7/48. Sposob wytwarzania kwasu cytronowego na podlozu zavlerаjacym skrobie/ E.Bolach W.Lesniak, J.Ziobrowski - N 215688, Заявлено 17.05.79, опубл. 30.06.85.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается технологии получения пищевых органических кислот, а именно лимонной кислоты, методом глубинной ферментации. Способ включает гидролиз крахмальной суспензии, осуществляемый путем разжижения крахмальной суспензии с содержанием сухих веществ 26-36 мас. % с помощью ферментного препарата бактериальной α-амилазы из расчета 0,5-1,5 ед. амилолитической активности на 1 г сухого вещества крахмала, добавление минеральных солей и ферментацию с помощью Aspergillus niger. Перед добавлением солей крахмальную суспензию выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. В качестве исходного крахмалосодержащего сырья используют очищенную крахмальную суспензию - полупродукт производства крахмала с концентрацией сухих веществ 36%. Технический результат состоит в расширении сырьевой базы и экологической чистоте технологии. 1 табл.

Способ получения лимонной кислоты на основе питательной среды, содержащей гидролизат крахмала и минеральные соли, включающий гидролиз крахмальной суспензии ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию питательной среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger, отличающийся тем, что проводят гидролиз крахмальной суспензии, содержащей 26 - 36 мас.% сухих веществ, ферментным препаратом α-амилазы, взятым в количестве 0,5 - 1,5 единиц амилолитической способности на 1 г сухого вещества крахмала, а перед добавлением минеральных солей крахмальную суспензию выдерживают под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 30 мин.