Векторная плазмидная ДНК рТК 1261, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины, и способ ее конструирования Советский патент 1991 года по МПК C12N15/79 

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантов вируса осповакцины (ВОВ).

Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП.

Сконструирована рекомбинантная плазмида рТК 1261, содержащая векторную часть, а также нуклеотидную последовательность ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП с полилинкером ВНУТРИ него.

Плазмидная ДНК рТК 1261 размером 3574 н.п. состоит из:

векторной части в виде Clal-PvuII фрагмента ДНК плазмиды pBR 322 Д длиной 2313 н.п., содержащего ген устойчивости к ампициллину в качестве генетического маркера;

фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП, кодирующего последовательность ТК-геО00

на от до 1379 н. и содержащего слитый полилинкер, плазмид рТК 1285 и pUC 8, имеющего ATG-кодон и три уникальных сайта с постферментативным формированием 3 -концевых участков

днк (GCATG C, GGTAC C и GAG,).

Способ конструирования рекомбинан- тной плазмидной ДНК рТК 1261 включае в себя:

гидролиз плазмидной ДНК рТК 1285 рестриктазами Hindlll к Eco RI с целью частичного удаления полилинкера плазмиды;

гидролиз плазмидной ДНК pUC 18 рестриктазамин Hindlll и Eco RI с целью выделения полилинкерной ДНК;

лигирование линеаризованной плаз- миды с целью получения целевой плазмидной ДНК рТК 1261.

Способ конструирования позволяет ввести полилинкер с уникальными сайтами расщепления ферментов Clal, Hindlll, SphI, Sal GI, Xbal, Bam HI, Smal, Kpnl, SacI и Eco RI внутри

ТКтена.

Сущность изобретения заключается в том, что для интеграции чужеродного генетического материала в геном ВОВ конструируют плазмидный вектор, со- держащий ТК-ген с прилегающими районами Hindlllг К-фрагмента ДНК ВОВ и уникальные сайты рестрикции Hindlll и Eco RI, по которым клонируют поли- линкео. Искусственно введение 1 О уникальных сайтов рестрикции исполь- зуют для клонирования чужеродных генов, которые методом котрансфекции интегрируют в ДНК ВОВ,

П р и м е р 1. Конструирование векторной плазмидной ДНК рТК 1261.

5 мкг плазмидной ДНК рТК 1285 подвергают совместному гидролизу эндо- нуклеазами рестрикции Hindlll (5 е.а.) и Eco RI (5 е.а.) в 10 мМ трис-HCl, (рЫ 7,5) и 10 мМ 2-меркап- тоэтанола; 50 Мм NaCl, 10 мМ MgCl при 37°С 60 мин, как описано. После тепловой денатурации белков при 65 С в течение 20 мин продукты ДНК разде- ляют электрофорезом в 4%-ном полиак- рипамидном геле (ПААГ) и выделяют больший фрагмент ДНК.

20 мкг плазмидной ДНК pUC 18 расщепляют ферментами Hindlll и Eco RI, как описано, и выделяют HindTII- Eco RI-полилинкер из 8%-ного ПААГ.

Линеаризованную плазмидную ДКК рТК 1285 Hind III Eco RI и Hindlll

.

п

5

0

5

Eco RI-полилинкер сшивают ДНК-лига- зой фагг Т4 (1 е„а.) в 50 мМ трис НС1, рН 7,5; 0,5 мМ АТР9 10 мМ 2-мер- каптоэтанола, 5 мМ MgCla при 8°С 12 ч. Препарат ДНК осаждают .спиртом.

1/10 часть ДНК трансформируют в компетентные клетки штамма E.coli НВ 101. Плазмидную ДНК (рТК 1261) выделяют щелочным методом из положительно гибридизующейся in situ колонии E.coli и подвергают рестрикцион- ному анализу. Структуру полилинкера подтверждают секвенированием ДНК от Clal-сайта рестрикции методом Максама- Гилберта.

Приме р2. Получение рекомби- нантного BOBS содержащего ген VPT вируса гепатита А штамма HAS 15.

Плазмидную ДНК рТК 1285-Р -VPI- HAV расщепляют рестриктазами Bam HI я Eco RI в стандартных условиях. С- концевую часть гена VPI ВГА выделяют из 4%-ного ПААГ п сшивают с Bam HI- Eco RI линеаризованной плазмидой рТК 1261 с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli НВ 101 и отбирают копонии ДРК-ДНК™ гибридизацией. Рекомбинактные колеку- лы ДНК (рТК 1261-CVPЈ-HAV) анализируют рестриктазами Bam HI, PvuII и Eco RI.

Плазмидную ДНК рТК 1.285-Р -VPI- HAV гидролизуют эндонуклеазами рестрикции Clal и Bam HI. Выделяют меньший фрагмент ДНК, содержащий поздний промотор BOB и N-концевую часть гена VPI ВГА, и сшивают с Clal-Bam HI линеаризованной плазмидой рТК 4261- CVPI-HAV. Отбирают рекомбинантные молекулы ДНК (рТК 1261-Р -VPI-HAV) и анализируют рестриктазами Eco RI, Pstls Bam ill и Clal.

ДНК плазмиды рТК 1261-Р -VPI-HAV используют для трансформации клеток почки зеленой мартышки CVI, зараженных ВОВ штамма ЛИВП. Урожай вируса после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клеток Н143. Б присутствии 25 мкг/мл бром- дезогсиуридина отбирают вирусные ТК- клоны. Методом ДНК-ДНК-гибридизации проверяют наличие гена VPI ВГА в клонах. Вирусную рекомбинантную ДНК выделяют, как описано, и подвергают анализу рестриктазой Hindlll.

Таким образом, сконструирован новый плазмидный вектор рТК 1261, име51Л

ющий расширенный состав сайтов рестрикции внутри ТК-гена BOB (Clal, Hindlll, SphI, FstI, Sal GI, Xbal, Ваш HI, Smal, Kpnl), что позволяет клонировать чужеродную ДНК без ATG- кодона с помощью коннекторного способа (в отличие от известного). На примере гена VPI вируса гепатита А продемонстрирована возможность использования плазмиды рТК 1261 для получения вирусных рекомбинантов.

Предлагаемое техническое решение может найти применение при создании генно-инженерных живых вакцин на основе ВОВ.

Формула изобретения

1. Векторная плазмидная ДНК рТК t26l, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины размером 3574 н.п., содержащая:

фрагменты ДНК pBR 322, имеющие последовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2968-4357 н.п., последний из которых с геном устойчивости к ампициллину;

фрагменты ДНК вируса осповакцины, расположенные на расстоянии 142- 736 н.п. и 769-1379 н.п. от Hindlll- сайта рестрикции К-фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП, кодирующие N- и

0

5

636

С-концевые части ТК-гена соответственно;

Clal -Hind III- и Hindlll - Eco RI - фрагменты ДНК плазмид рТК 1285 и - pUC 18 длиной 6 и 50 н.п. соответственно с участками узнавания рестрик- таз Clal, Hindlll, SphI, PstI, Sal Gl, Xbal, Ban HI, Smal, Kpnl, SacI, Eco RI;

участок инциации трансляции: ATG- кодон в последовательности GCATGC;

сайты рестрикции с постферментативным формирова шем 3 --выступающих концов: SphI, PstI, Kpnl, SacI;

уникальные сайты рестрикции Clal, Hindlll, SphI, Sal GI, Xbal, Bam HI, Smal, Kpnl, SacI и Eco RI;

генетические маркеры плазмиды: 0 - устойчивость к ампициллину;

емкость от 100 до 1,4 тыс, н.п.;

штаммы-хозяева: штаммы E.coli dam -фенотипа.

2. Способ конструирования векторной плазмидной ДНК рТК 1261 для получения рекомбинантов вируса осповакцины, заключающийся в том, что совместным гидролизом рестриктаз Hindlll и Eco RI получают лиьеризовакную плазмаду рТК 1285 Hindlll Eco RI и полилинкеркую ДНК плазмиды pUC 18 размером 50 н.п., которые сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4, и получают целевую векторную плазмиду рТК . 1261.

5

5

0

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую интеграцию чужеродного генетического материала в геном вируса осповакцины (ВОВ) штамма ЛИВП. Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена вируса осповакцины штамма ЛИВП. Новая плазмидная ДНК рТК 1261 состоит из фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, расположенных на расстоянии 142-736 н.п. и 769- 1379 н.п. от HindIII-сайта рестршс- ции К-фрагмента генома ВОВ, слитого полилинкера плазмид 1285 и pUC 18 длиной 56 н.п., содержащего уникальные сайты рестрикции Clal, HindIII, SphI, PstI, Sal GI, Xbal, Barn HI, Smal, Kpnl, SacI, Eco RI и векторной части в виде Clal-PvuII фрагмента ДНК плазмиды pBR 322 Д . Предложенная векторная конструкция позволяет расширить стратегию клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП. Полученная генно-инженерная субстанция характеризуется на способность интегрировать в геном ВОВ чужеродный генетический материал, например ген VPI вируса гепатита А штамма HAS 15 с поздним промотором ВОВ Р . 2 с.п. ф-лы. § (Л с о Ј