СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСТОТЫ БИОМАССЫ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 A61K39/04 C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к биологии и медицине, может быть использовано при получении диагностических препаратов и вакцин для определения чистоты биомассы микобактерий, не растущих на питательных средах, выделенных из инфицированных тканей людей и животных, например M. leprae, M. lepraemurium.

Известен способ обнаружения клеток тканей человека в суспензиях M. leprae, выделенных из биоптатов кожи больных лепрой людей, с помощью световой и электронной микроскопии (1). Недостатком способа является его низкая чувствительность в результате того, что регистрируются только целые тканевые клетки или субклеточные структуры (ядра, клеточные стенки и т.п.), но не выявляются растворимые компоненты тканевых клеток.

Известен способ характеристики степени тканевого загрязнения суспензии микобактерий М. leprae, выделенных из печени инфицированного броненосца с помощью иммуноблотинга и иммуноферментного анализа по детекции печеночного (2). Однако этот способ методически сложен, длителен и ограничен выявлением только белка печени броненосца.

Известен способ определения примеси тканевых компонентов в суспензии М. leprae, выделенных из лепром крыс и мышей, по наличию тканевой мелатдегидрогеназы при электрофорезе соникатов М. leprae (3). Недостатками способа являются: а) многоэтапность процедуры, включающей ультразвуковое разрушение микобактерий, электрофорез в агаре, специфическое окрашивание электрофореграмм на ферменты; б) низкая чувствительность.

Известен способ определения количества тканевых примесей в суспензии микобактерий введением суспензии внутрикожно морским свинкам, предварительно сенсибилизированным тканями человека или животного, с последующим учетом объема кожных реакций через 72 часа (4). Недостатками способа являются длительность и многоэтапность из-за необходимости предварительной (за 6 недель до опыта) сенсибилизации свинок.

Известен способ определения загрязнения культуры M. leprae, выделенной из лепромы броненосца методом газохроматографического анализа гидролизата культуры микобактерий лепры, по наличию длинноцепочечных вторичных спиртов (5).

Известен также способ идентификации микобактерий по спектру жирных кислот (6). Общим недостатком двух последних способов является то, что они не обеспечивают выявление тканевых остатков при определении чистоты биомассы микобактерий.

Цель изобретения повышение чувствительности и ускорение способа.

Предлагаемый способ включает выделение микобактерий из инфицированных тканей, очистку, газохроматографический анализ микобактерий с регистрацией превалирующего пика остатка миколовой кислоты и дополнительно пика миристиновой кислоты и использование их соотношения в качестве критерия чистоты препарата микобактерий.

В состав клеточных стенок микобактерий входят миколовые кислоты, представляющие собой высокомолекулярные гомологи альфа алкил- бета - гидроксикислот. Длина алкильного радикала миколовых кислот различна в зависимости от вида микобактерий. Так, у патогенных видов она составляет 24 атома углерода, у условно-патогенных и сапрофитных видов 20 и 22 атома углерода. При сопиролизе происходит деструкция миколовых кислот и этерифицированный остаток боковой цепи, удлиненный на 2 атома углерода, элюируется из колонки.

На фиг. 1 показана хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот M. leprae; на фиг.2 хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот M. lepraemurium; на фиг.3 хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот ткани подушечки лапки интактной мыши.

На хроматограммах микобактерий (фиг. 1 и 2) выявляются этерифицированные остатки миколовых кислот, содержащие от 22 до 28 атомов углерода. Превалирующим у M. leprae (фиг.1) является пик бегеновой кислоты (C_22:0), а у M. lepraemurium (фиг. 2) пик лигноцериновой кислоты (C_24:0).

На хроматограмме неинфицированной ткани (фиг. 3) миколовые кислоты и другие длинноцепочечные компоненты с числом атомов углерода более 20 не выявляются.

Как видно на фиг. 1-3, содержание кислоты C_14:0 (миристиновая кислота) одинаково как в тканях, так и в клетках микобактерий и составляет 1-2% от общего количества кислот, и принимается за 1.

Соотношение превалирующего пика остатка миколовой кислоты и миристиновой кислоты может служить критерием чистоты препарата микобактерий.

Способ осуществляется следующим образом.

Получение микобактерий. Микобактерии выделяют из инфицированных тканей и очищают по методу Дрейпера, включающему механическое разрушение тканей с последующей обработкой ферментами и детергентами (7).

Для изучения спектров жирных кислот микобактерий газожидкостной хроматографией применен метод сопиролиза (8), позволяющий получить метиловые эфиры жирных кислот без предварительной экстракции липидов из микробных клеток, что значительно сокращает время анализа до 1-2 часов.

Гидролиз и метилирование жирных кислот. 5-10 мг бактериальной массы помещают в стеклянную ампулу, добавляют несколько капель (0,1-0,2 мл) 7%-ного раствора гидроокиси тетраметиламмония в 80%-ном водном метаноле. Ампулу запаивают и прогревают при 120-130^oC в течение 20-30 минут. Проба приобретает вид прозрачного или опалесцирующего раствора.

Проведение анализа. Анализ проводят на газожидкостном хроматографе с пламенно-ионизационным детектором со стальными колонками длиной 1,5-2,0 м и диаметром 3 мм, заполненным целитом 545 (60-80 меш) с жидкой фазой 7%-ным апьезоном L при следующих параметрах:
температура термостата колонок в режиме программирования от 170 до 270^oC при скорости нагрева 5^oC/мин;
температура испарителя 370^oC;
газ-носитель аргон;
расход газа-носителя и водорода 2,4 л/мин, воздуха 25 л/час.

2-3 мкл анализируемого материала вводят микрошприцем в испаритель.

Оценка результатов. Площади пиков на хроматограммах определяют с помощью интегратора или умножения высоты пика на его ширину на половине высоты с последующим вычислением процента каждого пика от общей площади пиков или соотношения отдельных пиков.

Необходимо учитывать, что в зависимости от вида животного, органа, использованного для получения микобактерий, а также класса экспериментатора степень очистки может значительно варьировать.

Пример 1. Крыс заражают микобактериями лепры подкожно. Из инфицированных тканей крыс по методу Дрейпера выделяют микобактерии, степень очистки которых определяют предлагаемым способом по соотношению превалирующего пика остатка миколовой кислоты и пика миристиновой кислоты. В данном случае превалирующим является пик лигноцериновой кислоты (C_24:0).

Результаты представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что соотношение пиков лигноцериновой и миристиновой кислот колеблется от 4,3 до 15,2. Максимальное отмеченное значение в данном случае 15,2, что соответствует максимальной возможности метода Дрейпера. Выбор оптимальной величины соотношения зависит от задач экспериментатора и требований к чистоте препарата.

Пример 2. Мышей заражают микобактериями лепры интраплацентарно. Микобактерии из подушечек лап инфицированных мышей выделяют по методу Дрейпера. Степень очистки препарата определяют предлагаемым способом по соотношению превалирующего пика остатка миколовой кислоты и пика миристиновой кислоты. В данном случае превалирующим является пик лигноцериновой кислоты (C_24:0).

Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что соотношение пиков лигноцериновой и миристиновой кислот колеблется от 2,0 до 3,7, что указывает на незначительное количество микобактерий. Особенности тканей мыши не позволяют добиваться высокой степени очистки препарата.

Пример 3. Из селезенки броненосца, зараженного микобактериями лепры, выделяют микобактерии предлагаемым способом по соотношению превалирующего пика остатка миколовой кислоты и пика миристиновой кислоты. В данном случае превалирующим является пик бегеновой кислоты (C_22:0). Соотношение пиков составляет 7,1, что соответствует критерию достаточности очистки при сравнении с методами световой и электронной микроскопии.

Предлагаемый способ определения чистоты биомассы микобактерий по соотношению превалирующего пика остатка миколовой кислоты и миристиновой кислот обладает высокой чувствительностью, быстротой анализа и информативностью.

Источники информации:
1. Gan.G. Int.J.Leprosy. 1986, V,54, N 3, p.475-476
2. Quesoda-Pascual F. Gillis T.R. Buchanan T.M. Int.J.Leprosy 1981, V, 49, N 4, p.506-510
3. А.С. СССР N 1482398, кл. G 01 N 33/49, 1989
4. Дячина М.Н. Первухин Ю.В. Воробьева З.Г. Сухенко Л.Т. в сб. Материалы каракалпакской республиканской научно-практической конференции лепрологов, 1977, С.24-26
5. Lersson L. Draper Ph. Portaels F. Use of gas chromatography to differentiate M. leprae from cultivatble armadilloderived Mycobacteria - Int.J. Leprosy, 1985, 53,3, p.441-447
6. Пинчук Л.М. Лазовская А.Л. Липиды в таксономии и идентификации микобактерий, Горький, 1989.

7. Draper Ph. Int.J.Leprosy 1976, V, 14, N 4, p.95-98
8. Андреев Л.В. Склифес А.Н. Изв. АН СССР, сер. биол.1979, N 1, С.95-102.

Использование: в биотехнологии, медицине, идентификации чистоты биомассы микобактерий, газохроматографическом анализе. Сущность изобретения: способ включает выделение микобактерий из инфицированных тканей, их очистку и газохроматографический анализ метиловых эфиров жирных кислот очищенной биомассы микобактерий. При этом регистрируют превалирующий пик остатка миколовой кислоты и пик миристиновой кислоты. Определяют их соотношение, которое используют как критерий чистоты препарата (биомассы микобактерий). Способ позволяет выявить наличие тканевых остатков в биомассе очищенных микобактерий. 2 табл. 3 ил.

Способ определения чистоты биомассы микробактерий, включающий выделение микробактерий из инфицированных тканей, очистку и газохроматографический анализ биомассы микробактерий с регистрацией превалирующего пика остатка миколовой кислоты, отличающийся тем, что дополнительно регистрируют пик миристиновой кислоты и их соотношение используют как критерий чистоты препарата.