СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРОГЕННЫХ СВОЙСТВ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (ПИРОТЕСТ) Российский патент 1997 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике, и может быть использовано для оценки пирогенности лекарственных препаратов, предназначенных для парентерального введения, а также для контроля загрязненности продукции бактериальным эндотоксином на всех этапах фармацевтического производства.

Известен способ определения пирогенности лекарственных препаратов и растворов для парентерального применения путем их внутривенного введения кроликам с последующей регистрацией температуры тела. Однако оценка пирогенности на кроликах требует больших затрат на приобретение и содержание животных и может быть осуществлена только в специализированных учреждениях, обеспеченных вивариями. В больничных аптеках, в которых проводится подготовка растворов для парентерального введения, контроль растворов на пирогенность не проводится.

Задачей предлагаемого изобретения являлось снижение стоимости и повышение доступности способа.

Указанная цель достигается способом, которым пирогенные свойства препаратов определяют по содержанию в их растворах пирогена. В соответствии с изобретением лунки иммунологических планшет обрабатывают раствором исследуемого препарата и выявляют сорбированный в них пироген иммуноферментной реакцией с использованием сыворотки против гликолипида хемотипа Re, нативной сыворотки животных, протеина A, конъюгированного с ферментом, и смеси субстрата с хромогеном, а наличие или отсутствие пирогенных свойств устанавливают фотометрически по интенсивности окрашивания, при этом заключение о наличии пирогенных свойств делают в случае, если средний фотометрический показатель иммуноферментной реакции в исследуемой пробе значимо превышает тот же показатель в отрицательном контроле. Предпочтительно для сорбции пирогена использовать полистироловые планшеты.

В реакции применяли сыворотку против гликолипида хемотипа Re, нативную сыворотку животных и конъюгат протеина A с пероксидазой хрена производства Научно-производственного центра "Микроэкос" (Москва). Сыворотка к гликолипиду хемотипа Re данного производства получена путем иммунизации кроликов гликолипидом, который экстрагирован из клеток Salmonella minnesota R595 хлороформом и метанолом и переведен в водорастворимое состояние путем комплексирования с сывороточным альбумином. Нативная сыворотка была получена из крови неиммунизированных лабораторных животных. Смесь субстрата с хромогеном готовили путем смешивания 200 мл физиологического раствора NaCl, 2 мкл 33%-ного раствора перекиси водорода и 200 мкл раствора ортофенилендиамина (100 мл ортофенилендиамина солянокислого и 1 мл этилового спирта). В качестве положительного контроля, содержащего пироген, использовали раствор пирогенала (100 нг/мл) производства предприятия НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи РАМН. В качестве отрицательного контроля применяли апирогенную воду. Реакцию осуществляли в лунках полистироловых планшет для микротитрования и регистрировали по интенсивности окраски на многоканальном или одноканальном фотометре при длине волны 492 нм.

Способ осуществляется следующим образом.

В лунки полистироловой планшеты вносят по 100 мкл исследуемых проб (каждую пробу в две лунки), в две лунки вносят по 100 мкл апирогенной воды (отрицательный контроль). Кроме того, в две лунки вносят по 100 мкл раствора пирогенала в концентрации 100 нг/мл (положительный контроль). Планшеты выдерживают в течение 1 ч при 37^oC, затем вытряхивают содержимое из лунок и трижды промывают лунки бидистиллированной водой в объеме 100 мкл. Затем во все лунки вносят по 100 мкл 0,1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, выдерживают 1 ч при 37^oC и трижды промывают бидистиллированной водой в объеме 100 мкл. Далее в лунки вносят по 50 мкл сыворотки против гликолипида хемотипа Re и по 50 мкл нативной сыворотки животных, выдерживают при 37^oC 30 мин, вытряхивают содержимое из лунок и трижды промывают лунки бидистиллированной водой в объеме 100 мкл. В лунки вносят по 100 мкл конъюгата протеина A с пероксидазой, выдерживают 30 мин при 37^oC, вытряхивают содержимое лунок и трижды промывают бидистиллированной водой по 100 мкл. Затем в лунки добавляют по 100 мкл смеси субстрата с хромогеном, выдерживают 30 мин при 37^oC, останавливают реакцию путем добавления в каждую лунку по 50 мкл серной кислоты и учитывают результаты фотометрически при длине волны 492 нм по интенсивности желтоватого окрашивания при обязательном наличии такого окрашивания в положительном контроле. Средние фотометрические показатели в парных лунках с исследуемыми образцами при отсутствии пирогенности должны незначимо (менее чем на 2 сигмы) отличаться от среднего фотометрического показателя отрицательного контроля. Заключение о наличии пирогена делают в том случае, если средний фотометрический показатель исследуемого образца значительно превышает средний фотометрический показатель в отрицательном контроле. При наличии значимых различий показатель t достоверности разницы между средними должен быть равным не менее 1,96.

Расчет показателя t производят по формуле:

где t показатель достоверности разницы между средними фотометрическими данными;
E₁ сумма квадратов отклонений фотометрических показателей в лунках с исследуемым образцом от среднего фотометрического показателя исследуемого образца (x₁);
E₂ сумма квадратов отклонений фотометрических показателей в лунках с отрицательным контролем от среднего фотометрического показателя отрицательного контроля (x₂).

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Определяли пирогенность неочищенного препарата тимоптина, полученного в Научно-производственном центре "Гидробиос" из тимуса гренландского тюленя, и T-активина производства предприятия бактерийных препаратов "Биомед" им. Мечникова. Лиофильно высушенные препараты разводили в 1 мл дважды дистиллированной воды и вносили по 100 мкл в две лунки полистироловой планшеты. В две лунки вносили по 100 мкл раствора пирогенала в концентрации 10 нг в 1 мл (положительный контроль). Кроме того, в две лунки вносили по 100 мкл апирогенной воды (отрицательный контроль). Планшеты выдерживали в течение 1 ч при 37^oC, затем вытряхивали содержимое из лунок и трижды промывали лунки дистиллированной водой в объеме 100 мкл. Во все лунки вносили по 100 мкл 0,1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, выдерживали 1 ч при 37^oC и трижды промывали бидистиллированной водой в объеме 100 мкл. Далее в лунки вносили по 50 мкл сыворотки против гликолипида хемотипа Re и по 50 мкл нативной сыворотки животных, выдерживали при 37^o 30 мин, вытряхивали содержимое из лунок и трижды промывали лунки бидистиллированной водой в объеме 100 мкл. В лунки вносили по 100 мкл конъюгата протеина A с пероксидазой хрена, выдерживали 30 минут при 37^oC, вытряхивали содержимое лунок и трижды промывали бидистиллированной водой по 100 мкл. Затем в лунки добавляли по 100 мкл смеси субстрата с хромогеном, выдерживали 30 минут при 37^oC, останавливали реакцию путем добавления в каждую лунку по 50 мкл серной кислоты и учитывали результаты фотометрически при длине волны 492 нм.

Результаты определений:
пробы с тимоптином
исследуемый образец
x_i 310, 340
x₁ 325
отрицательный контроль
x_i 98, 120
x₂ 109

пробы с T-активином
исследуемый образец
x_i 120, 126
x₁ 123
отрицательный контроль
x_i 98, 120
x₂ 109

Заключение:
исследуемый образец тимоптина пирогенен
исследуемый образец T-активина не пирогенен.

Пример 2. Определение чувствительности способа. В лунки 5 полистироловых планшет вносили по 100 мкл растворов пирогенала в концентрациях 1, 2, 3, 4, 5, 10 нг/мл, а также апирогенную воду в качестве отрицательного контроля. Планшеты выдерживали в течение 1 ч при 37^oC, затем вытряхивали содержимое из лунок и трижды промывали лунки бидистиллированной водой в объеме 100 мкл. Затем в лунки вносили по 100 мкл 0,1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, инкубировали 1 ч при 37^oC и трижды промывали бидистиллированной водой в объеме 100 мкл. Далее в лунки вносили по 50 мкл сыворотки против гликолипида хемотипа Re и по 50 мкл нативной сыворотки животных, выдерживали при 37^oC 30 мин, вытряхивали содержимое из лунок и трижды промывали лунки бидистиллированной водой в объеме 100 мкл. В лунки вносили по 100 мкл конъюгата протеина A с пероксидазой, выдерживали 30 мин при 37^oC, вытряхивали содержимое лунок и трижды промывали бидистиллированной водой по 100 мкл. Затем в лунки добавляли по 100 мкл смеси субстрата с хромогеном, выдерживали 30 мин при 37^oC, останавливали реакцию путем добавления в каждую лунку по 50 мкл серной кислоты и учитывали результаты фотометрически при длине волны 492 нм.

Полученные результаты показали наличие пирогена во всех образцах, где концентрация пирогенала была равна 2 нг/мл и выше, при отрицательной реакции в образцах, содержащих 1 нг пирогенала в 1 мл.

Следовательно, способ позволяет выявить пирогенал при его концентрации 2 нг/мл и выше.

Пример 3. Сравнение результатов применения предложенного способа и метода оценки пирогенности на кроликах. Оценивали пирогенность 50 различных образцов препаратов (гамма-глобулин, сывороточный альбумин, T-активин, АКДС-вакцина производства предприятия "Биомед" им. Мечникова, тимоптин производства НПЦ "Гидробиос", интерферон производства предприятия НИИЭМ им. Гамалеи, экспериментальные серии шигеллезной вакцины производства НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова и др.). Реакции ставили на кроликах (по 3 кролика на каждую пробу) и предложенным способом. В тесте на кроликах образец считали пирогенным, если температура в среднем поднималась не менее чем на 0,6^oC. И тем и другим способом пирогенность была выявлена в 35 случаях, причем отмечено полное совпадение результатов применения обоих способов при оценке каждого образца.

Таким образом, предложенный способ по информативности не уступает способу определения пирогенности на кроликах. В то же время предлагаемый способ характеризуется значительно более низкой стоимостью, так как известный способ требует трех кроликов для одного определения, которых нужно содержать в течение довольно длительного срока, необходимого для подготовки и проведения испытания на пирогенность.

Кроме того, предложенный способ может быть использован практически в любом медицинском учреждении при наличии необходимых реагентов и фотометра, например фотометра АКИ-Ц-01.

Использование: в иммунодиагностике для оценки пирогенности лекарственных препаратов, предназначенных для парентерального введения, и контроля загрязненности продукции бактериальным эндотоксином на всех этапах фармацевтического производства. Сущность изобретения: пирогенность препаратов устанавливают in vitro по наличию в них пирогенов, который сорбируют в лунках планшет, предпочтительно полистироловых, и выявляют при помощи иммуноферментной реакции с использованием сыворотки против гликолипида хемотипа Re, нативной сыворотки животных, протеина A, конъюгированного с ферментом, и смеси субстрата с хромогеном. Результаты реакции учитывают фотометрически по интенсивности окрашивания. Заключение о наличии пирогена делают в случае, если средний фотометрический показатель исследуемого образца значимо превышает тот же показатель отрицательного контроля. Способ выявляет пироген в концентрации не менее 2 нг/мл. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ определения пирогенных свойств фармацевтических препаратов, отличающийся тем, что лунки иммунологических планшет обрабатывают раствором исследуемого препарата и выявляют сорбированный в них пироген иммуноферментной реакцией с использованием сыворотки против хемотипа R_е, нативной сыворотки животных, протеина А, конъюгированного с ферментом, и смеси субстрата с хромогеном, а наличие или отсутствие пирогенных свойств устанавливают фотометрически, при этом заключение о наличии пирогенных свойств делают в случае, если средний фотометрический показатель иммуноферментной реакции в исследуемой пробе значимо превышает тот же показатель в отрицательном контроле. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для сорбции пирогена используют полистироловые планшеты.