Способ получения пептидов Советский патент 1989 года по МПК C07K14/61 A61K38/18 A61K38/25 

Изобретение относится к спосоЬу получения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - способ получения новых соединений в ряду пептидов, малотоксимных и обладающих более высокой эффективностью в отношении стимулирования выделения гипофизом гормона роста.

Пример 1. Синтез пептида D-NMA , -гСКГ(1-29)-Ш2 имеющего следующую формулу: H-His-D- -NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser- -Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Oly-Gln-Leu- -Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-mi7Aосуществляют последовательно с применением пептидного синтезатора Бекман 990 на смоле МВНА, имеюи ей интервал замещения около 0,1-0,5 ммоль/г смолы. Связывание Boc-ArgCToS) со смолой осуществляют обычным способом с использованием смеси хлористого метилена и ДМФ при температуре около 60 С, в течение ч при перемешивании с использованием 2 г смолы и 2 ммолей Arg и получают замещение около 0,35 ммолей Arg на 1 г смолы.

После деблокирования и нейтрализации пептидная связь постепенно образуется на смоле. Деблокирование, нейтрализацию и прибавление каждой аминокислоты проводят обычным способом. Все растйорители, которые применяют, тщательно дегазируют посредством продувки инертным газом, например, гелием или азотом.

Деблокирование предпочтительно проводят согласно режиму А:

РеагентВремя сме60 TFA 11% этандитиол 60% TFA /2% Этандитиол IPA зтандитиол (10%) в Me ОН

Et,N (10%) в МеОН (дважды) (дважды)

Сочетания предпочтидили согласно режиму В

Реагент

DCC1 вое - аминокислота

МеОН (дважды) (дважды) (ЗМ) в

0,5 0,5 15,0 0,5

МеОН0,5

(дважды)0,5

В общем от 1 до 2 ммоль аминокислоты, защищенной БОС, (трет-бутоксикарбонил), в хлористом метилене, ДМФ или их смеси, применяют на 1 г смолы плюс один эквивалент 1,0 моль DCC1 (Ы,ы -дициклогексилкарбодиимида) в хлористом метилене в течение 2 ч.

При сочетании BOC-Arg (ToS) применяют смесь 50DMF (диметилформамид) и хлористый метилен. Эфир PZI применяют как группу, защищающую гидроксил боковой цепи для защиты 8ег(серин)

Q и Thr (треонин). Амидогруппу Авп

(аспарагин) или Gin (глютамин) защищают ксантилом (Хап), когда применяют предпочтительную связь DCC (М,н - дициклогексилкарбодиимид). Можно

5 также применять Р-нитрофениловый

сложный эфир (ONp) для активирования концевой карбоксильной группы Asn или Gin и, например, можно связывать BOC-Asn (ONp) в течение ночи, применяя один эквивалент HOBt в смеси диметилформамида (DHF) и хлористого метилена, причем в этом случае DCC не добавляют. Для защиты Lys (лизин) с боковой цепью применяют 2-хлор-бензилоксикарбон14Л- (2C1-Z)TO8

5 применяют для защиты гуанидиновой группы Arg и имидазольный азот His, карбоксильную группу в боковой цепи Gin или Asp защищают OBZ1. Фенольную гидроксильную группу защищает 2,6-ди0 хлорбензил (DCB). В конце синтеза по- лучают следующий состав: Bpc-His-D- -NMA-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-- -Ser(XO-Ser(X)-Tyr(Xг)-Arg(Xй)- -Arg(Xj)-lle-Leu-Gly-Gln(X)-Leu5 -Туr(XT)-Ala-Arg(Xe)-Lys (X-j)-Leu-Leu- -His-Gln(Xj)-Ile-Nle-A8n(Xf)-Arg(X)- MBHA , где X - DCB (2,6 где Xj - DCB (2,6-дихлорбензия), X, - OBZl;

0 X,. - BZ (дибензиловый эфир), Xg- - Xan, Хб - ToS; X7 - 2C1-Z.

5 Xan (ксантил) можно частично или полностью удалять посредством обработки с TFA, применяемой для деблокирования группы защиты об -аминокислоты.

51

Для отделения и снятия защиты с защищенного пептида на смоле его обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл ме тилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода на 1 г пептида-смолы при 0°С в течение 30 мин. После удаления фтористого водорода в условиях высокого вакуума остаток из смолы и пептида попеременно промывают сухим диэтиловым эфиром и хлороформом и затем пептид извлекают с помощью дегазированной 2 н. водной уксусной кислоты и отделяют от смолы путем фильтрования.

После этого отделенный пептид, освобожденный от защиты, растворяют в 0-5%-ной уксусной кислоте и подвергают очистке, которая может включать тонкое фильтрование через гель сефадекс G-50.

Затем пептид дальше посредством препаративной или полупрепаративной HPLC. Патроны, снабженные составом LC-500 фирмы Уотера Лссо- сиэйтз, набивают 15-20 мг кремнеземом С,} от Vydac (ЗООЛ). Градиент CHjCN в ТЕАР создается устройством низкого давления Eldex gradient maker. Хроматографические фракции тщательно контролируют посредством HPLC причем собирают только фракции, показывающие значительную чистоту; Обес- соливание очищенных фракций, отдельно проведенных на чистоту, достигается при применении градиента вО,.1%ТРА (трифторуксусной кислоте). Затем вырезанную центральную часть лиофилизируют для получения требуемого пегТтида чистотой свыше 98.

Получают 7,2 мг пептида, имеющего амидированный конец С цепи, с выходом около 5% от количества отщепленного пептида.

П р и м е р 2. Синтез пептида ID-NMA ,ser ,ine -гскг(1-29)-Шг,

имеющий формулу: H-His-D-N IA-Asp-Ala -Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile -Leu-Gly-Gln-T,eu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Gln-Ile-tlle-Asn-Arg-MHпроводят постепенно в синтезаторе Бекман 990 на смоле МВНА, аналогично примеру 1. При применении TLC с HPLC получают очень чистый пептид.

П р и м е р 3. Синтез hGRF-- аналогового фрагмента .D-№1A , -hGRF(1-29)-™2., имеющего формулу: H-Tyr-D-miA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tvr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gl n-Leu

15

300976

-Ser-Ala-Arg-Ly s-I,eij-J,eu-Cln-Asp-lI e -Nle-Ser-Arg-mia

проводят постепенно в синтезаторе для пептидов типа Бекман 990 на смо- 5 ле МВНА согласно примеру 2.

Применяя TLC (тонкослойную хроматографию) и HPLC, устанавливают, что получают практически чистый пептид. Q Примера. Синтез части аналога hGRF b-NMA ,Nle ,D-Arg J -ЬСГ.Г

(1-29)-KHt. имеющего формулу: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ald-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-C-ly-Gln-Leu--Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- -Ile-Nle-Ser-D-Arg-m; проводят последовательно в синтезаторе Бекман 990 для синтеза пептида на смоле ШHA аналогична примеру 1,

2Q При применении 1ЪС и HPLC получают практически чистый пептид.

П р и м е р 5. СинтезtD-Leu , Nle J-rGRF(1-29)-Wl2, имеющего формулу:

25 H-His-AIa-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser- -Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-Leu-Cly-Gln- -Leu-tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Gln-Ile-Nle-Asn-Arg-m 2проводят последовательно в синтезаторе Бекман 990 для синтеза пептидов на смоле МВНА, как в примере 1. При применении TLC и HPLC получают практически чистый пептид.

П р и м е р 6. Синтез П-ГО1А , ,Asn J-hGRF-(1-29)-mig, имею- 35 щего формулу:

H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile Phe-Thr- -Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu- }ly Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- -II e-Nle-Asn-Arg-IIHj

30

40

проводят последовательно в пептидном

синтезаторе Бекман 990 на смоле МБНА, как в примере 1. Пептид оценен как практически чистый, применяя TLC и HPLC.

Пример7. Синтез fNle, D-Arg 2j -rGPJ (1-29)-HH2, имеющего формулу:

H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Tbr-Ser- -Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Gln-Ile--Nle- sn-D-Arg-NH2 проводят постепенно в синтезаторе Бекман 990 на смоле ШHA, как в примере 1. По данным TLC и HPLC, получается практически чистый пептид.

П р и м е р 8. Синтез аналогового hGRF фрагмента fn-roiA ,D-Tyr ° , Nle -hGRF(1-29), имеющего формулу :

H-Tyr-D-ri A-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- -Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys- VAl-Leu-Gly- -Gln-Leu-Ser-Ala-Arp,-Ly8-Leu-Leu-Gln- -Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-mij

проводят, постепенно в синтезаторе Бекман 990 на смоле ШHA, как в примере 1. При применении TLC и HPLC получают в основном чистый пептид.

Примерз. Синтез аналогового hCRF фрагмента /JD-NMA .Nle U-hCRT (l-29)-NHEt, имеющего следующую формулу :

H-Tyr-D-IJMA-Asp-Ala-lle-Phe-Thr- -Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- -Ile-Nle-Ser-Arg-iraCHjCH осуществляют последовательно в пептидном синтезаторе Бекман 990 на N-алкиламиновой смоле, называемой также N-этиламинометиловой смолой (смолой NEAM). Приблизительно 10 г 1 сшитой хлорметилированной поли стирольной смолы вводят в реакцию с 50 мл этиламина при температуре око- ло k С в течение приблизительно 36 ч при непрерывном перемешивании для замены хлорбензильных групп на N-этил- аминобензильные группы и после завершения реакции несколько раз про- мывают метанолом и водой. Затем на первоначальной замещенной амидной связи синтезируют пептид. После получения нужной рептидной последовательности проводят снятие защиты и отщепление от смолы обработкой фтористоводородной кислотой с анизолом в качестве акцептора, проводя сначала перемешивание, при О С, а затем оставля смесь медленно нагреваться при .пере- мешивании до комнатной температуры в течение приблизительно 3 ч, при этом пептид отщепляют от смолы в виде этиламида. По данным TLC и HPLC получают практически чистый пептид.

Примерю. Синтез D-NMA , Nle ,(1-29)-miEt имеющего следующую формулу:

H-Tyr-D-tlMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- -Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp -Ile-Nle-Asn-Arg-ITHGH Ql, проводят последовательно с использованием пептидного синтезатора Бекман 990 на смоле МЕАМ аналогично приме- ру 9. По данным TLC и HPLG этот аналоговый пептид является практически чистым.

0

5 5 Q

:)

0 5

5

0

П р и м е р 1 1 .

Синтез аналогового liGRF фрагмента His ,D-NMA2, -hGRF(l-29)-NH имеющего следующую формулу:

H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- -Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arp.-I.ys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-IIH

осуществляют последовательно с использованием пептидного синтезатора Бекман 990 на смоле ШНА аналогично примеру 1. По данным TLG и HPLG пептид является практически чистым.

Результаты анализа приведены в таблице.

Проведены биологические испытания синтетических пептидов, приготовленных в примерах.

Для сравнения использован искусственный человеческий фактор выделения гормона роста. В опытах in vitro обнаружено, что пептиды, полученные в условиях предлагаемого способа обладают в общем большей мощностью для секреции гормона роста (GH) и подоб- ных присущих им активностей. Все эти искусственные пептиды рассматриваются как биологически активные и потенциально полезные для стимуляции выделения гормона роста через гипофиз.

При проведении испытаний применяли культуры, включающие клетки гипофиза крысы, удаленные 3-5 дней назад.

Такие культуры считаются оптимальными для секреции гормона роста и их применяют в сравнительном испытании, проводимом согласно способу Вейла. Инкубационный период для испытываемого вещества составил З- ч. Лликвоты культивируемой среды удалили и обрабатывали для измерения их содержимого в иммунореактивном гормоне роста GH(ir GH) способом радиоиммунологии.

Результаты сравнительного испытания для эквимомерЯых концентраций показаны в таблице.

Испытания in vitro искусственных пептидов показывает, что многие из них обладают более высокой биологи- ческой силой, чем, например (в части мозга под зрительным бугром) hpGRF (1- «0)-ОН: минимальная эффективная концентрация, Д-изомер аланина, нор- лейцин -человеческий hGRF(1-29)ами- ногруппа составляет примерно 1 ммоль.

Помимо испытаний in vitro для секреций гормона роста искусственные пептиды вводили внутривенно крысамсамц-ям с анес (езиуованием уретаном. При этом 1;скусстренные пептиды подавляют самопроизвольную секрецию гормона роста без уничтожения реакции на наружный фактор выделения гормона роста (GH). До инъекции спустя 10, 30 и 90 мин брали анализ крови. Уровни гормона роста (СИ) в крови, измеренные пробирочной радиоиммунологией,

показали, что искусственный Гл-изо5 - 27 т

мер аланина, норлеицин J-человеческий hGRF( 1-29)-Mil J примерно в 6 раз сильнее, чем человеческий hGRF(1- jO)pH в отношении уровней в крови гормона роста, выделяемого гипофизом, при измерении через 10 и 30 мин после инъекции. Для подтверждения этих результатов применяли другие известные испытания in vitro фактора выделения гормона роста (GRF), которые эффективны в определении секреции гормона роста. Считают, что дозы примерно 50 нг и примерно 5 мг этих пептидов на 1 кг веса тела являются эффективными, чтобы вызвать секрецию гормона роста.

Некоторые пептиды, которые обладают равной или даже слегка меньшей биологической силой в испытаниях in vitro, чем стандарт, в жизни имеют значительно большую силу.

Такие искусственные аналоги человеческого hGRF и крысиного GRT, бычьего и поросячего аналогов (в upGRF)

R -Rj-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R -Ser- -Arp-R,4.-R,5-Ri4 C-ly-Gln-Leu-R 8 - -Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R -R j-R -Nle- 49 Y,

His;

DOTIA;

где R - Tyir, R - Ala.

10

15

Rg - Ser,Asn;

-Tyr,DTyr;

R,i -Arg,Lys;

R,, - lie,Val; R, - DLeu, Leu;.

Rie -Tyr,Ser;

Rg -His,Gin;

Rjj - Gin,Asp; 26 - lie;

R-jg - Asn,Ser;

20

25

30

28

Rja -Arg, DArg; Y- - NH, при условии, что или RZ DOTIA,

или R - DLeu, или - DArg,

отличающийся тем, что Вое Arg(Tos) или Вое D Arg(tos) связывают с полимерной смолой НБНА или NEDM, Вос-защитную группу отщепляют и затем строят пептидную цепь, постепенно присоединяя аминокислотные в последовательности, обусловленной формулой I, полученный при этом пептидилполимер общей формулы II

X,-R,(X или X)-Rz.,)-Ala- -Ile-Phe-Thr(X)-Rg-(X4. или Xj-)- -Ser(X4) (Xj)-Arg(X6)-Ri (Xg или X7)-R,, -R ,4-Gly-Gln(X5-)-Leuмогут быть отнесены к категории мало- 35 (X)-Ala-Arg(X6,)-Lys(X7)-Leu-Leu-R24(X или Xj))Ile-Nle-R2g(X или X5.)-R29(X6)-Xg, где X - тозил, Х, Вое; Y - 2,6-дихлорбензил,

токсичных соединении.

Таким образом, проведенные биологические, испытания показали, что пептиды, полученные в условиях предлагаемого способа, малотоксичны и обладают более высокой эффективностью в отношении стимулирования выделения гормона роста гипофизом в сравнении с синтетическим человеческим фактором выделения гормона роста hGRF()OH. Кроме того, получаемые данным способом пептиды имеют более короткую цепь (29 аминокислотных остатков), что значительно упрощает их получение.

Формула

зобретения

Способ полумения пептидов общей формулы I

R -Rj-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R -Ser- -Arp-R,4.-R,5-Ri4 C-ly-Gln-Leu-R 8 - -Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R -R j-R -Nle- 49 Y,

His;

DOTIA;

где R - Tyir, R - Ala.

0

5

Rg - Ser,Asn;

-Tyr,DTyr;

R,i -Arg,Lys;

R,, - lie,Val; R, - DLeu, Leu;.

Rie -Tyr,Ser;

Rg -His,Gin;

Rjj - Gin,Asp; 26 - lie;

R-jg - Asn,Ser;

0

5

0

28

Rja -Arg, DArg; Y- - NH, при условии, что или RZ DOTIA,

или R - DLeu, или - DArg,

отличающийся тем, что Вое Arg(Tos) или Вое D Arg(tos) связывают с полимерной смолой НБНА или NEDM, Вос-защитную группу отщепляют и затем строят пептидную цепь, постепенно присоединяя аминокислотные в последовательности, обусловленной формулой I, полученный при этом пептидилполимер общей формулы II

X,-R,(X или X)-Rz.,)-Ala- -Ile-Phe-Thr(X)-Rg-(X4. или Xj-)- -Ser(X4) (Xj)-Arg(X6)-Ri (Xg или X7)-R,, -R ,4-Gly-Gln(X5-)-Leu5 (X)-Ala-Arg(X6,)-Lys(X7)-Leu-Leu-R g (X)-Ala-Arg(X6,)-Lys(X7)-Leu-Leu

-R24(X или Xj))Ile-Nle-R2g(X или X5.)-R29(X6)-Xg, где X - тозил, Х, Вое; Y - 2,6-дихлорбензил,

OBZ1,

бензиловый эфир,

ксантил,

тозил,

2-С1-бензилоксикарбонил,

смола-носитель ГВНА или NEAJ, деблокируют и отцепляют пептид от смолы-носителя и/или с использованием фтористого водорода в сочетании с анизолом или метил-этилсульфидом или их смесью в качестве акцептора при температуре от О до -20°С, полученный продукт растрзоряют в уксусной кислоте и очищают.

X. - Х4

хГ

XT Х-

Изобретение касается пептидов, в частности получения соединений общей ф-лы I: R₁ - R₂ - ASP - ALA - ILE - PHE - THR - R₈ - SER - R₁₀ - ARG - R₁₂ - R₁₃ - R₁₄ - GLY - GLN - LEU - R₁₈ - ALA - ARG - LYS - LEU - LEU - R₂₄ - R₂₅ - R₂₆ - NLE - R₂₈ - R₂₉ - Y, где R₁ - TYR, HIS

R₂ - ALA, DNMA

R₈ - SER, ASN

R₁₀ - TYR, D=TYR

R₁₂ - ARG, LYS

R₁₃ - ILE, VAL

R₁₄ - D=LEU, LEU

R₁₈ - TYR, SER

R₂₄ - HIS, GLN

R₂₅ - GLN, ASP

R₂₆ - ILE

R₂₈ - ASN, SER

R₂₉ - ARG, D=ARG

Y - NH₂, NHC₂H₅ при условии, что или R₂ - DNMA, или R₁₄ - D=LEU, или R₂₉ - D=ARG, которые способны вызывать секрецию природного гормона роста, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных пептидов. Их синтез ведут из BOC-ARGTOS или BOC-D-ARG(TOS), который связывают с полимерной смолой MBHA или NEAM с последующим отщеплением BOC-защитной группы. Затем проводят постепенное наращивание пептидной цепи в последовательности, указанной в ф-ле I. Полученный пептидилполимер общей ф-лы II: X₁ - R₁(X или X₂) - R₂ - ASP(X₃) - ALA - ILE - PHE - THR(X₄) - R₈(X₄ или X₅) - SER(X₄) - R₁₀(X₂) - ARG(X₆) - R₁₂(X₆ или X₇) - R₁₃ - R₁₄ - GLY - GLN(X₅) - LEU - R₁₈(X₂) - ALA - ARG(X₆) - LYS(X₇) - LEU - LEU - R₂₄(X или X₅) - R₂₅(X₃) - ILE - NLE - R₂₈(X₄ или X₅) - R₂₉(X₆) - X₉, где X - тозил

X₁ - BOC

X₂ - 2,6- дихлорбензил

X₃ - OBZL

X₄ - бензиловый эфир

X₅ - ксантил

X₆ - тозил

X₇ - 2-хлорбензилоксикарбонил

X₉ - смола-носитель MBHA или NEAM, подвергают деблокированию и отщеплению пептида от смолы-носителя с использованием фтористого водорода в сочетании с анизолом или метилэтилсульфидом, или их смесью в качестве акцептора при температуре от 0 до(-20)°С с последующим растворением полученного продукта в уксусной кислоте и очисткой, например, тонким фильтрованием через гель сефадекс G-50. Новые пептиды оказывают влияние на секрецию гипофизарных желез, что можно использовать для промотирования роста животных или в диагностической практике. 1 табл.