Способ получения пептидов Советский патент 1988 года по МПК C07K14/61 A61K38/25 A61K38/18 

И:зобретение относится к способу получения пептидов - цовых биологически активных соединениГ), которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - синтез новых производных пептидов - малотоксичных, обладающих более высоког способностью промотировать выделение гормона роста.

Пример 1. Синтез пептида tD-Glu ,Nle- -rhGRF(1-29)-NH2, H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser- Ser-Tyr Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-DGlu-Ile-Nla- Asn-Arg-NH проводят моностадийно на пептидном синтезаторе Бекман 990 с использованием 2 г смолы МВНА, имеющей диапазон замещения 0,1 - 0,5 ммоль/г- смолы. Присоединение ВОС- Atg(TOS) к смоле осуществляют используя KF в смеси 50% в метиленхло- рнде при 60 С в течение 24 ч при пе- эемешивании, при этом происходит замещение 0,35 ммоль Arg на 1 г смолы,-После деблокирования и нейтрализации на смоле стадия за стадией строят пептидную цепь. Все используемые растворители тщательно дегазируют барботированием И1гертного газа, например гелия или азота, чтобы гаран- гировать отсутствие кислорода, который мог бы привести к нежелательному окислению серы Met-остатка.

Деблокирование предпочтительно проводят в соответствии с графиком эпераций А:

Реактив

1

2

60% TFA/2% этандитиол 60%-. TFA/2% этандитиол

3.1РА/1% этандитиол

4.ЕЬзН(10%) в

5.МеОН

6.Et3N(10%) в

Время смешивания, мин

10

15

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

ЫеОП (дважды) 8. (дважды) Присоединения предпочтительно гфо- одят в соотве- ствии с графиком опе- аций В:

Реактив Время смешивания, мин

9. DCG1

10, ВОС-амино- кислота

50-90

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

11.МсОН (дважды)0,5

12. (дважды) 0,5

13. (ЗМ) в

,15,0

14.СГ-ЦСЦ0,5

15.МеОИ0,5

16. (дважды) 0,5

В кратком изложении, 1-2 ммол). ВОС-защи ценной аминокислоты в мет ленхлориде используют на 1 г смолы, добавляют один эквивалент 1,0 М DGG1 в метиленхлориде в течение 2 ч для большинства аминокислот, за исключением BOG-Arg(TOS). BrL-зфир использован в качестве защищающей гид- роксил боковой цепи группы для Ser и Thr. Амидогруппы Asn и Gin защищены с помощью Хап, когда используется DGC-присоединение, что и предпочтено. Р-нитрофенильиьй эфир (ONP) также может использоваться цля активации кар- боксиль гого конца Asn или Gin, например BOC-Asn-(OHP) может быть при- соеди 1ен в течение ночи с использованием одного эквивалента HOBt в 50% смеси ДМФА и метиленхлорида, в этом случае DCC не присоединяется, 2-Хлор- бензилоксикарбонил-(2С1-2) использован в качестве защитной группы для боковой цени LgS. TOS использован для гуанидиногруппЕ. Arg и ими- дазольного азота liis, а карбоксильная группа боковой цепи Gin или Агр защищена с .помощью OBZ1. Фенольная гидроксильная группа TYr защищена с помощью 2,6-дихлорбензила (DCB). В конце синтеза получают полимерную смолу следующего состава: BOG- N t-leHis (X)-Ala-Asp (Х,)-А1а-11 e-Phe- Thr(X) -Ser(X)-Ser(x 4)-Tyr(X2)- Arg(X)-Arg(Xp-Ile-Leu-Gly -Gln(X,r) Leu-Tyr,(X) -Ala-Arg (X g) -Lys (X 7) -Leu- Leu-Hi s (X)-Glu(Xj)-II e-Met-A3h(X 5-) Arg(X)-X3,

где X-TOS,X2-DGB,X3-OBZ1,, Xg-Xan, ,-X-,-2Gl-Z и X представляет собой - NH-переметилбенз- гидриламин, Хап может быть частично или полностью удален с помов;ью TFA- обработ ки, используемой для деблокирования с -ам1-1нозащитной группы.

Для расщепления и удаления защиты 5,4 г защищенной пептидосмолы обрабатывают с помощью 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода (HF) на 1 г пептиДо- смолы при -20 С в течение получаса и при О С в течение получаса. После

3

удаления фтористого кодорода в вакууме остающийся смолопептид промывают чередованием сухого диэтилового эфира и .хлороформа, затем пептид экстрагируют. 2N дегазированной уксусной кислотой получают 2,84 г (путем фильтрования).

Расщепленный и лишенный защиты пептид после этого растворяют в 0-5% уксусной кислоты и. подвергают очистке, которая может включать ультрагель-фильтрацию на Сефадекс-50, получают 204,4 мг.

Затем пептид очищают препаратив- ный ЖХВД, Кассеты, устанавливаемые- на препаративном жидкостном хроматографе LC-500 производства фирмы Уотерс ассошиэйтс набивают двуокисью кремния типа С/ -Silica 15- 20 мкм (фирма Вайдэк) (ЗООА). Градиент CHjCN в ТЕАР создают с помощью градиентного аппарата Элдекс низкого давления, хроматографические фракции тщательно контролируют с по- мощью ЖХВД и собирают лишь те, для которых характерна существенная чистота. Высаливание очищенных фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществляют с использованием кассет 15-20-мкм С-18 и 15-20 мкм фенил и градиента в 0,1% TFA. Центральная фракция затем подвергалась лио- фильной сушке, получают 89,2 мг целевого пептида, чистота которого превышает 98%.

Пример 2. Синтез пептида DLeu ,Nle hpGRF(1-29)MH2, Н, Tyr-Ala-Asp-Ala-I.le-Phe-Thr-Asn-Ser- Tyr Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-DLeu-His-Gln-Tle-Hle Ser-Arg-NH осуществляют методом последовательных стадий с использованием пептидного синтезатора Бекман 990 на смоле МВНА по примеру 1.

Судя по данным TLC и .HPLC, пептид получен существенно чистым, выход 165 мгГо -53,3(, уксусная кислота).

Пример 3. В этих же условиях получены пептиды: DLeu ,Nle rGRf(1-29) H-His-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Ser- Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu- Gly-Gln-DLeu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu- DLeu-His-Gln-Jle-Nle-Asn-ArgNH, выход 226,7 МГ, -51,2(, уксусная кислота). TLC и HPLC подтвердили чистоту пептида.

ю152025 зо

4Б

50

55

1)G 1 n , N I г Ь pCR F ( I -29) Kfj ,: НТуг-А1л-Лчр-Л1я-Тle-Phc-Thr-Asn- Ser-Tyr-Ari -l.-ys-Vfll-Leu-Gly-Gln-Leu- Ser-Ab4-Arg-Lys-V.eu-Leu-Gl ii-DOln-I l.o- N1 o-Ser-Ari JJH „ ныход 204,4 мг, ofjp -50,0°(C 1, уксусная кислота).

N«MeTyг DGln JrhGrF(1-29)NHг: чХмеТуг-А a-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser- Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu- Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-DGln- Ile-Met-Asn-ArgNH, выход 52 мг, -51, У (, уксусьгая кислота). Данные TLC и HPLC подтвердили существенную чистоту пепт1зда.

Для- определения эффективности полученных синтетических пептидов в промотировании выделения гормона роста были осуществлены испытания in vitro с использованием синтетического hpGRF(1-40)-ОН в качестве стандарта. Испытывались пептиды в эквимолярных концентрациях. Применяемые культуры включали клетки гипофиза крысы, удаленного за 3-5 дней до эксперимента. Для сравнительных испытаний использовали культуры, которые считаются оптимальными для секреции гормона роста.

Инкубирование с испытуемым веществом проводили в течение 3-4 ч, а/1ИК- воты культуральной среды отбирали и переносили для измерения их содержимого в иммуноактивный GH(ir GH) и проводили испытания хорошо-охаракте- ризованньм радиоиммунным способом.

Результаты этого сравнения с hpGRF(1-40)OH для эквимолярных концентраций представлены в таблице.

Испытания in vitro этих синтетических пептидов показывают, что каждый из них проявляет полную внутреннюю биологическую активность hpGRF (1-40)-ОН.

Максимально эффективная концентрация для tDLeu 3 , hpGRF(1- 29)NH2 1 нмоль.

Б дополнение к испытаниям iti vitro цля секреции гормона роста провели эксперименты in vivo введением синтетических пептидов через вживленный катетер в свободно двигающегося нор- мально амца крысы после предварительной обработки их FLA-63, ингибитора допамин гидроксилазы, которьй подавляет спонтанную секрецию GH без воздействия на реакцию к экзогенному GRF. Через тот же катетер сразу же, через 5 и 20 мин после введения были

514

взяты образцы крови. Уровни GH в крови, измеренные радиоиммуиологически, показьгеают, что синтетические пептиды, полигенные в условиях способа, являются мощными стимуляторами секреции гипофизной GH и, кроме .того, проявляют более длительное действие. Другие известные тесты GRF in vivo, которые являются эффективными для обнаружения секреции GH, использовали для подтверждения этих результатов. Рассматривали дозы от 1бО кг до 50 мкг этих пептидов на кг живого веса, которые являются эффективными в воздействии на GH секрецию.

Проведенными испытаниями установлено, что соединение по изобретению относится к категории малотоксичных.

Таким образом, соединения, полу- ченные в УСЛОВИЯХ данного способа, обладают более высокой активностью в отношении промотирования секреции гормона роста, чем известный промотор hpGRF( 1-40)ОН, кроме того, они про- явл яют более длительное действие.

Формула изобрет

Способ получения пептидов формулы I

R,-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Th Ser-Tyr-Arg-Rj -R, -Leu-GlyR j-Ala-Arg-Lys-Leu-R 3-R,j4Nle-Rf9-Arg-NH,

R: -N MeTyr ,His;

где Rg - Ser,Asn , .

Arg,Lys . Ile,Val

Ryy - Leu или DLeu

Tyr,Ser

Leu или D-Leu

R/J4- His,Gin

Gln,DGTn или Asp

Rjj- Asn,Ser

576

.отличающийся тем, что защищенный BOG и TOS аргинин связывают с метилбензигидриламиновой смолой, защитную вое группу отщепляют и проводят постепенное наращивание лептрщ- ной цепи в последовательности, соответствующей формуле I, используя 1-2 ммоль защищенной аминокислоты на грамм полимерной смолы, процесс ведут в диметилформамиде, метиленхло- риде или их смеси и от полученной при этом пептидной смолы формулы II

,(Xg или Xj)-Ala-Asp(Х2)-А1 а- Ile-Phe-Thr(X)-Rg (Х или Xf )-Sej:(y.)Ter(X2)-Arg(X)-Rf2 (Х или

Leu-Gly-Gln(Xf)-R,7-R,j (;,;)-AlaArg(X)-Lys(X7)-Leu-R - К или

X/r)-R53(X3)-Ile-Nle-R2(X или Х)Arg(Xj)-NH-Z,

где Х -.водород, БОС;

Xj - водород, 2,6-дихлорбензоил;

Xj - водород или OBZ1;

Х - водород или бензил;

Xj -- водород или ксантил;

Х - водород или тозил;

Х - водород или 2-хлорбензилоксикарбокил;Z - ВНА, МЬНА,

отщепляют защитные группы и полимерную подложку, обрабатывая пептидил- полимер трифторуксусной кислотой или фтористь( водородом при (-.20)- 0°С в присутствии анизола и/или ме- т иленсульфида и целевой продукт выделяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Приоритет по признакам

13.09.83 при R N MeTyr , Rg-Ser, , Rij-Il. RpLeu, Н,-Туг, Rlj-Leu, R.i4,-His, R j-DGlu, R g-Ash;

25.10.83 при , Rg-Ash, Ri jr-Lys, RfjVal, R T-DLeu, R g-Ser, R.jj-DLeu, , Rjf-Glu, Asp, Rjjg-Ser.

1.hpGRF(1-40)

2.t N MeTvr Nle JrGP.Fd29),

3. D-Leu-f ,Nle hpGRF(129)HH2

4.tD-Leu ,Nle hpGRF(129)NHj

5. D-Glu2,Nle 1hpGRF(129)

2,2

9.3

7,2.

6,2

5,8

Изобретение касается пептидов, в 1ас1 ности соединений общей ф-лы I R,-Ala-Asp Ala-Ile Phe-Thr-Rg-Ser- Tyr-Arg-R -R ,-Leu-Gly-Gln-R .-R |g - Ala-Arg-Lys-Leu-R2j-R24-R2S-Tle-Nle- R g-Arg-NHj, где R - N- Me-Tyr или His; Rg- Ser или Asn; Rf - Arg или Lys; R fi - He или Valj R,- - Leu или D-Leu-; R yg - Tyr или Ser; - Leu или D-Leu; R - His или Glu; R 25- - Glu или D-Glu или Asp; - A.sn или Ser, которые обладают способностью прокотировать вьщеление гормона роста, что может быть использовано в сельском хозяйстве; Цель изобретения - создание новых более активных и менее токсичных пептидов. Их синтез ведут из з ащищенного группой вое или ТОС аргинина, который связывают с метилбензгидриламиновой смолой (МБГАС) с последующим отщеплением группы БОС. Затем проводят последовательное наращивание пептидной цепи в указанной в ф-ле I последовательности с использованием 1-2 ммоль защищенной аминокислоты на 1 г смолы МБГАС. Процесс ведут в среде диметил- формамида и/или метиленхлорида1 Получают пептидную смолу общей ф-лы II. ,(Х)или Xi-Ala-Asp(X -Ala-Ile- Phe-Thr(X4)-RJ(X4Или Xj)-Ser(X - Tyr (X,2)-Arg(X)-R ,(Х или X7)-Ri3-Leu-Gly- Gln(Xj)-R п-R (8 (Xj)-Ala-Arg(Xg)- Lys(Xp-Leu-R23-Ri4(X6 или X)- R(Xj)-Ile-Nle-R28 (X или Xj)-Arg- NH-Z, где R, -Rg, R (г-т;, , R fT-re указаны; или БОС; или 2,6-дих.порбензоил; X или OBZ1; или бензил; или ксантил; или тозил; Х-,Н или 2-хлорбензил- оксикарбонил; или МВНА. В этой смоле отщепляют защитные группы и полимерную подложку обработкой или HF при (-20)-0 С в присутствии анизола и/или метиленсульфида,- Целевой продукт выделяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления . Новые пептиды в сравнении с ичвестным hpGRF(1-40)OH обеспечивают лучшую активность при более длитель-. ном времени действия (до 9,3 ч против 2,2 ч)и невысокую токсичность. 1 табл. g О) С 4k СП Ч см