ШТАММ БАКТЕРИЙ ZOOGLOEA ADAPT С-92, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ СОРБЕНТА ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к промышленной и экологической микробиологии, биотехнологии очистки стоков и касается получения нового штамма, продуцирующего экзополисахариды, обладающего высокой адсорбционной емкостью, способного к флокуляции и использованию нефтепродуктов в качестве источника углерода в аэротенках при утилизации городских сточных вод.

Известно применение микроорганизмов для очистки сточных вод от растворенных металлов и утилизации органических примесей.

Известен штамм Cunnighamella blakesleeana, клеточные стенки которого способны связывать ионы меди (6,3 мм), кобальта (2,1 мм), а также цинка, железа и кадмия [1]
Недостатком данного штамма является необходимость предварительной обработки биомассы для получения фракции, содержащей бактериальные оболочки, а также то, что связывание металла процесс температурозависимый и имеет оптимум pH, что негативно сказывается при использовании его в технологии очистки стоков, так как температура в аэротенке не стабильна, а pH варьирует в пределах от 7 до 10.

Известен штамм Desulfovibrio desulfuricans, используемый для очистки промышленных сточных вод от растворенных металлов за счет связывания их в нерастворимые сульфиды образованным бактериями сероводородом [2]
Недостатком данного штамма является невозможность использования его при очистке городских сточных вод в аэротенке, так как это строгий анаэроб и неизвестно влияние токсичных органических примесей на активность продукции сероводорода.

Известен штамм Proteus mirabilis, выделенный из активного ила установки по переработке сточных вод, который способен размножаться в присутствии 300 мг/л кадмия и сорбировать его из среды. Покоящиеся клетки сорбируют до 0,7 мг/л, растущие 0,22 мг/л кадмия при концентрации в среде 1 мг/л [3]
Недостатком данного штамма является его специфичность по отношению к ионам кадмия, а наличие в стоках суммы катионов тяжелых металлов предполагает использовать бактерии, эффективно сорбирующие ряд катионов. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Наиболее близким к изобретению является штамм Zoogloea ramigera, синтезирующий экзополисахариды, которые действуют как полиэлектролиты и сорбируют катионы таких металлов, как кобальт, медь, кадмий и железо. Сорбция достигает 95% от всего количества присутствующих в растворе катионов при их концентрации от 12 до 117 мг/л [4]
Штамм имеет следующие недостатки: не адаптирован к условиям работы в сточных водах аэротенка, содержащих большое количество токсичных веществ, необходимость предварительной обработки биомассы, которая заключается в иммобилизации бактерии на носителе альгинате кальция, а также дорогостоящие среды для его поддержания, включающие витамин B₁₂ и аминокислоты - аргинин и аланин.

Цель изобретения получение штамма, продуцирующего экзополисахариды, эффективно сорбирующего ионы тяжелых металлов в условиях сточных вод аэротенка, изобилующих токсическими примесями, способного использовать в качестве источника углерода нефтепродукты, находящиеся в стоках, неприхотливого к питательным средам и не требующего специального оборудования для выращивания.

Цель достигается использованием штамма Zoogloea adapt C-92 ВКПМ В-7040 - сорбента ионов тяжелых металлов.

Предлагаемый штамм получен методом селективной адаптации на питательных средах, содержащих соли тяжелых металлов, с последующим скринингом наиболее стабильных форм.

Полученный штамм Zoogloea adapt C-92 депонирован ВКПМ НИИ генетика 30.05.1995 под регистрационным номером В-7040.

Штамм депонирован с научным описанием (паспортом).

Штамм Zoogloea adapt С-92 ВКПМ В-7040 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, 0,5 1,0 x 1,0 - 3,0 мкм, подвижные, в средах с повышенным содержанием солей тяжелых металлов клетки округлые, более мелкие. Цист и спор не образуют. Могут агрегировать в микроскопические хлопья, которые свободно плавают. Образуют экзополисахариды. Количество полимера и степень флокуляции зависит от возраста культуры и состава среды. Окраска по Граму грамотрицательны.

Культуральные признаки. Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем. Оптимальная температура роста 25 28^oC, pH 7,0 7,2. Культуру поддерживают пересевом на плотных питательных средах, хранят в растворе глицерина при 70^oC или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки. Аэроб не восстанавливает нитраты, индол и сероводород не образует, хемоорганотроф, каталазо- и оксидазоположителен, окисляет глюкозу, рамнозу, сахарозу, лактозу.

Для культивирования Zoogloea adapt C-92 применяют среду М9 следующего состава, г/л: Na₂HPO₄ 6; KH₂PO₄ 3; NaCl 0,5; NH₄Cl 1; вода дистиллированная остальное с добавлением 1,5% глюкозы. Культивирование проводят на термостатированных качалках или в ферментерах при 28^oC и интенсивной аэрации 18 24 ч.

Выход биомассы 10⁹ кое/мл.

Штамм Zoogloea adapt C-92 ВКПМ В-7040 идентифицирован по определителю Берги [6]
Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются
эффективная сорбция ионов тяжелых металлов в условиях аэротенка;
простая питательная среда;
обычное оборудование, применяемое для культивирования аэробных бактерий.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и не использовался в промышленной технологии, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Пример 1. Получение штамма бактерий Zoogloea adapt C-92. Новый штамм Zoogloea adapt C-92 получают путем выделения из активного ила сточных вод городских канализационных очистных сооружений и последующей селекцией на среде М9, насыщенной ионами меди. Бактерии засевают в среду М9 с добавлением меди в форме CuSO₄ в количестве 120 мг/л, инкубируют при 28^oC с аэрацией 15 сут, затем пересевают в свежую среду с более высокой концентрацией меди. Ряд пересевов бактерий позволяет отобрать микроорганизмы устойчивые к 290 мг/л меди. Они обладают повышенной устойчивостью к ионам цинка, железа, свинца и кобальта (таблица). Полученные бактерии эффективно сорбируют ионы тяжелых металлов. После инкубирования в средах без меди бактерии сохраняют свои свойства.

Пример 2. Получение биомассы и сорбция ионов меди бактериями Zoogloea adapt C-92 в лабораторных условиях. Биомассу получают выращиванием бактерий в ферментере в виде суспензии на среде М9 с добавлением 1,5% сахара. Температура инкубирования 28^oC, pH 7,0, рост происходит в аэробных условиях 24 ч. Полученную биомассу отмывают от среды дистиллированной воды и осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 8 тыс. об/мин. Медь добавляют в форме CuSO₄, сорбцию проводят при 25^oC 1 ч. Остаточную медь определяют по методике Тихомировой Л.П. [5] Было показано, что 10¹¹ бактерии сорбируют 0,56 мг меди в неростовых условиях.

Пример 3. Определение устойчивости бактерии Zoogloea adapt С-92 к ионам меди. Изучение устойчивости бактерий к повышенному содержанию ионов меди проводят на сточной воде из аэротенка с содержанием (мг/л): железо 1,0; свинец 0,012; медь 0,06; фенол 0,05; нефтепродукты 1,0 с добавлением 300 мл/л среды М9 и дополнительной меди в форме CuSO₄ в количестве 78 мг/л. В колбу емкостью 0,5 л вносят 0,2 л подготовленной среды и инокулируют ее 0,2 мл бактериальной суспензии. Начальный титр бактерий составляет 2,7•10⁵ кое/мл. Культивирование осуществляют при 28^oC с аэрацией в течение 5 сут. Концентрация бактерий при этом увеличилась до 5,0•10⁶ кое/мл, что составляет 15% от контрольного варианта, культивируемого без внесения добавочной меди.

Пример 4. Изучение динамики развития штамма Zoogloea adapt C-92 в присутствии нефтепродуктов. Для изучения динамики развития штамма на среде М9 в присутствии 5% нефтепродуктов (соляр: керосин: отработанные масла в соотношении 43 5 52) бактерии (3,6•10⁴ кое/мл) засевают в среду и инкубируют 5 сут с аэрацией при 28^oC. Концентрация бактерий при этом увеличивается до 2,0•10⁷ кое/мл, что соответствует росту бактерий на среде М9 в присутствии 0,2% сахара.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
эффективная сорбция ионов тяжелых металлов в условиях аэротенка;
Способность использования нефтепродуктов в качестве источника углерода;
простая питательная среда;
обычное оборудование, применяемое для культивирования аэробных бактерий.

Список литературы.

1. Venkateswerlu G. Stotzky G. Appl. Microbiol. and Biotechnol. 1989, v. 31, N 5 6, p. 619 625.

2. Патент Российской Федерации RU 201 78114. Штамм бактерий Desulfovidrio Desulfuricans, используемый для очистки промышленных сточных вод от ионов тяжелых металлов.

3. Andreoni V. Finoli C. FEMS Microbiol. Ecol. 1991, v. 85, N 3, p. 183 191.

4. Sabine P. Kuhn. Pfister P.M. Appl. Microbiol. and Biotechnol. 1989, v. 31, p. 613 618.

5. Tихомирова Л. П. Водоснабжение и санитарная техника. 1994, N 11, с. 30.

6. Краткий определитель бактерий Берги Под ред. Дж. Хоулта, М. Мир, 1980.

Использование: в технологии очистки сточных вод городских канализационных очистных сооружений. Сущность изобретения: предложен новый штамм Zoogloea adapt C-92, полученный путем селективной адаптации штамма, выделенного из активного ила сточных вод городских канализационных очистных сооружений. Штамм устойчив к воздействию ионов тяжелых металлов, сорбирует ионы тяжелых металлов, использует нефтепродукты в качестве источника углерода. 1 табл.

Штамм бактерий Zoogloea adapt С-92 ВКПМ В-7040, используемый в качестве сорбента ионов тяжелых металлов.