ШТАММ БАКТЕРИЙ SPHINGOBACTERIUM MIZUTAE-32 - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ SPMI, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5'-АТ'CGAT-3' Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12N9/52 C12N9/22 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к поиску новых штаммов - продуцентов биологически активных веществ, перспективных для микробиологической промышленности и генной инженерии, и касается получения нового штамма, обладающего свойством роста при низких температурах и продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-ATCGAT-3'.

Психрофильные микроорганизмы мало изучены из-за их экстремальных условий обитания и трудности их выделения. Однако в настоящее время они привлекают все больше внимания ученых.

Эндонуклеаза рестрикции данной специфичности используется для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов и ранее не обнаружена в штаммах рода Sphingobacterium.

В настоящее время в литературе описаны изошизомеры данной эндонуклеазы рестрикции [3]. Однако ни один из них не выделялся из психрофильных микроорганизмов и не проявлял оптимума действия ниже 10°С.

Известны несколько штаммов [2-8], способных продуцировать эндонуклеазу рестрикции (сайт узнавания 5'-ATCGAT-3'). Однако ни один из них не относится к роду Sphingobacterium.

В литературе приводятся данные о выходе ферментов для некоторых изошизомеров [4-7]. Выход фермента ClaI из штамма Caryophanon latum L составляет 400 Е/г [6], BsmI из Bacillus species-12000 Е/г [7], а BspXI из Bacillus sphericus - 42000 Е/г [4]. Однако в последнем штамме содержатся два фермента, а не один, как в нашем штамме. Наличие нескольких эндонуклеаз рестрикции всегда затрудняет процесс выделения чистого препарата фермента.

Наиболее доступным и близким к заявляемому штамму является штамм В. Stearothermophilus 29, продуцирующий рестриктазу Bsa29I [3, 5], прототип.

Штамм культивируется при температуре 50°С. Фермент сохраняет активность от двух до шести месяцев хранения при -20°С. Выход фермента составляет 12000 ед/г препарата.

Недостатком данного штамма является невысокий выход эндонуклеазы рестрикции и отсутствие способности расти при низких температурах.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-ATCGAT-3', с высоким выходом фермента, стабильного при хранении и способного проявлять высокую активность при низкотемпературных условиях реакции.

Поставленная техническая задача решается выявлением и использованием штамма-продуцента сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции SpmI.

В процессе анализа образцов талой воды был выделен штамм Sphingobacterium mizutae, являющийся продуцентом эндонуклеазы рестрикции, названной SpmI согласно общепринятой номенклатуре [1]. Штамм культивируется при низких температурах и является продуцентом эндонуклеазы рестрикции, обладающей высокой активностью при температуре 6-10°С. Фермент является изошизомером известной эндонуклеазы рестрикции ClaI [2], но отличается от выделенных ранее изошизомеров тем, что он более активен при низких температурах и полностью инактивируется при 50°С.

Согласно классификации Бердже этот род был описан еще в 1983 г. и включает 3 вида, выделенные из рода Flavobacterium [8].

Идентификацию проводят общепринятыми методами [9-10].

Штамм обладает следующими свойствами.

Палочки прямые, спор не образуют, грамотрицательные, неподвижные, каталазоположительные. Ферментируют лактозу и сахарозу. Растет на минимальной среде с лактозой. Колонии первоначально белые, непрозрачные, через несколько суток инкубации при комнатной температуре становятся желтыми. Индол не образует, желатину не гидролизует. Образует кислоту из углеводов в результате их окисления, газ не выделяет. Штамм утилизирует рамнозу и характеризуется отсутствием дезоксирибонулеазы; отсутствие образования кислоты при окислении маннитола, этанола и гликогена. Штамм относится к психрофильным микроорганизмам, не растет при 37°С, хорошо растет при температуре 6-20°С.

Вид идентифицирован по определителю [8] как штамм бактерии Sphingobacterium mizutae 32.

Полученный штамм Sphingobacterium mizutae 32 депонирован в НИИ ККМ Государственного Научного Центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером В-907, а продуцируемая им рестриктаза названа SpmI согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм хранится в лиофильном состоянии и в питательной среде с глицерином.

Для культивирования Sphingobacterium mizutae 32 применяют среду следующего состава (г/л): бактотриптон (Difco) 10.0, дрожжевой экстракт (Difco) 5.0, NaCl 5.0, рН 7.0-7.2.

Для получения препарата фермента штамм выращивают в поллитровых колбах в качалке при 200 об/мин и 12-14°С в течение 48 ч или в холодильнике при температуре 6°С. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре 4-5°С. Выделение проводят путем хроматографической очистки на фосфоцеллюлозе Р-11 ("Whatman", Англия). Все операции по выделению SpmI проводят при температуре 4-5°С. Клетки суспендируют в буфере А (10 мМ калийфосфатный буфер рН 7.5, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0.1 мМ ЭДТА) из расчета 4 мл на 1 г биомассы и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе ("MSE", Англия), затем осветляют центрифугированием на центрифуге J-21B ("Bekman", США) со скоростью 18000 об/мин в течение 30 мин. Экстракт наносят на колонку (1.6×14 см) фосфоцеллюлозы Р-11 ("Whatman", Англия), промывают буфером А и смывают фермент в градиенте концентрации NaCl (0.0-0.8 М). Фракции, содержащие рестриктазу, диализуют против буфера В (10 мМ трис-HCl рН 7,5, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 0.1 мМ ЭДТА). Фракции с ферментом диализуют против 50%-ного раствора глицерина в буфере А.

Для электрофореза используют агарозу фирмы "Sigma", США. Рестрикционный анализ проводят в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис рН 7.5, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол (ДТТ) и 1 мкг ДНК λсI857 при температуре 6-10°С.

Выход фермента из 10 г клеток составляет 300000 ед. акт. За единицу активности (Е) принимают минимальное количество фермента, которое в течение 1 ч при температуре 6-10°С в оптимальных условиях полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага λcI857.

Штамм является уникальным не только по наличию данной эндонуклеазы рестрикции, но и имеет дополнительные свойства. Клетки штамма способны расти при низких температурах, а фермент гидролизует ДНК фага лямбда и Т7 при температуре 6-10°С.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является:

- штамм относится к роду Sphingobacterium и растет при низких температурах,

- высокая продуктивность штамма, превышающая по данному показателю штамм-прототип,

- высокая стабильность фермента (сохранение активности в течение двух недель хранения при +20°С),

- широкий температурный оптимум работы фермента, в результате чего расширяется температурный спектр его использования в области низких температур.

Для определения узнаваемой последовательности нукпеотидов эндонуклеазой рестрикции SpmI проводят сравнение экспериментально полученных путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле фрагментов, образующихся при гидролизе ДНК фага λсI857. Результаты сравнительного анализа позволяют сделать вывод, что данная эндонуклеаза рестрикции узнает последовательность нуклеотидов (5'-CTGCAG-3').

На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага λсI857 ферментом Spml (дор.1), SpmI и Bsa29I (дор.2) Bsa29I (дор.3), (сайт узнавания 5'-ATCGAT-3') (дор.3).

Как видно из представленной фиг.1, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

Интерпретация полученных экспериментальных данных позволяет утверждать, что исследуемая эндонуклеаза рестрикции является изошизомером рестриктазы Bsa29I и может заменить его во всех молекулярно-биологических и генно-инженерных работах. Также установлено, что Bsa29I и SpmI и имеют общую точку расщепления и гидролизуют ДНК между нуклеотидами Т и С. Таким образом, впервые выделена эндонуклеаза рестрикции из психрофильного штамма, относящегося к роду Sphingobacterium, имеющая оптимальную температуру рестрикции 6-10°С.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента. Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Косяки помещают в холодильник при температуре 10±2°С. После 42 ч инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой.

Культивирование проводят в холодильном шкафу "MSE, Англия" при 10±2°С с аэрацией, при перемешивании 200 об/мин. Клетки собирают центрифугированием на центрифуге J-21 при 5000 об/мин и температуре 4-5°С. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводят при описанной выше методике.

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента. Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза ДНК Фага лямбда (фиг.1). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-ATCGAT-3'.

Пример 3. Определение влияния температуры на активность фермента. Гидролиз ДНК фага лямбда проводят в стандартных условиях, но при различных температурах от 6 до 50°С в течение 60 мин. Фермент полностью инактивируется при 50°С, сохраняет свою активность при 37°С, максимальная активность наблюдается при температуре 6-10°С (фиг.2, табл.1).

ТаблицаСохранение активности рестриктазы SpmI при разных температурах инкубации№п/пТемпература инкубации, °СНаличие полного гидролиза *16+210+320±437±550-* - Гидролиз проводят в стандартных условиях с 1 мкг ДНК λсI857, в течение 1 ч

Поскольку эндонуклеаза рестрикции SpmI имеет сайт узнавания AT^CGAT, идентичный сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Bsa29I, которая также является изошизомером ClaI, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Пример 4. Культивирование штамма. Клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на скошенную агаризованную среду. Культуру на скошенном агаре помещают в термостат на 37±2°С. После 48 ч инкубации роста клеток не наблюдают.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Roberts R.J., Belfort M., Bestor Т., Bhagwat A.S., Bickle T.A., Bitinaite J. // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31. - P.1805-1812.

2. Kessler C., Neumaier P.S., Wolf W., (1985) Gene, vol. 33, pp.1-102.

3. Roberts R.J., Vincze Т., Posfai J., Macelis D. // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31 - P.418-420.

4. Zieger M., Patillon M., Roizes G., Lerouge Т., Dupret D., Jeltsch, J.M.// Nucleic Acids Res - 1987. - V.15 - P.3919.

5. Repin V., Lebedev L., Puchkova L., Serov G., Terechenko Т., Chizikov V., Andreeva I.// Gene. - 1995. - V.157. - №1-2. - P.321-322.

6. Mayer, H., Grosschedl, R., Schutte, H., Hobom, G., Nucleic Acids Res., - 1981. - vol.9, p.4833-4845.

7. Суджювене О.Ф., Тарасов А.П. // Мол. генет. микробиол. вирусология, 1987. №4, с.19-22.

8. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1; Пер. с англ./ Под ред. Дж.Хоулта, H.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уилльямса. - M.: Мир, 1997. - 432 с.

9. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./ Под ред. Ф.Герхардта и др. - M.: Мир, 1984. - 264 с.

10. А.С.Лабинская. Микробиология с техникой микробиологических исследований - M.: Медицина, 1972. - 479 с.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм бактерий Sphingobacterium Mizutae-32, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, названную SpmI, которая узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5'-AT'CGAT-3'. Штамм выделен из талой воды в результате поиска штаммов-продуцентов эндонуклеазы, способных проявлять высокую активность при низких температурах. Штамм способен расти при температуре 6°С, сохраняет стабильность в течение двух недель хранения при +20°С, а продуцируемый штаммом фермент гидролизует ДНК фага лямбда и Т7 при температуре 6-10°С. Выход фермента из 10 г клеток 300000 ед. акт. 2 ил., 1 табл.

Штамм бактерий Sphingobacterium mizutae-32, депонированный в НИИ коллекции культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" под №В-907 - продуцент эндонуклеазы рестрикции Spml, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-AT'CGAT-3'.