ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOMYCES SP. ST-12 - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5'- CTGCAG -3' Российский патент 1999 года по МПК C12N9/14 C12N1/14 C12N9/14 C12R1/465 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'- CTGCAG -3'.

Рестриктаза такой специфичности широко используется для использования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Providencia Stuartii 164, продуцирующий рестриктазу PstI (сайт узнавания 5'-CTGCAG-3') [1]. Основными недостатками данного штамма являются: нестабильность фермента после очистки (срок хранения несколько недель), активность фермента не указана, штамм является клиническим изолятом.

Известно несколько продуцентов - изошизомеров этой рестриктазы.

Известен штамм Caulobacter fusiformis BC-25, который способен продуцировать рестриктазу Cfu I (сайт узнавания 5'-CTGCAG-3') [2]. Основными недостатками штамма являются: низкое содержание данной рестриктазы, наличие 2 эндонуклеаз рестрикции (CfuI, CfuII), что значительно усложняет стадии выделения и очистки ферментов.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Streptomyces albus, продуцирующий единственную рестриктазу SalPI [3, прототип]. Фермент сохраняет активность от двух до восьми месяцев хранения при -20^oC в зависимости от метода выделения. Выход фермента составляет 6000 ед/мл препарата. Термостабильность фермента не указана (отсутствует).

Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Недостатком данного штамма является невысокий выход рестриктазы.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-CTGCAG-3', с высоким выходом фермента, стабильного при хранении.

Поставленная задача решается выявлением и использованием штамма - продуцента сайт-специфической рестриктазы Ssp12-I.

Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска новых продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм streptomyces Species ST-12 депонирован в НИИ Коллекции культур микроорганизмов Государственного Научного Центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером B-679, а продуцируемая им рестриктаза названа Ssp-12I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Streptomyces sp. ST-12 относится к серой серии стрептомицетов и характеризуется следующими свойствами:
Морфологические: клетки нитевидные, неподвижные, ветвящиеся, грамположительные. Воздушный мицелий в зрелом состоянии образует цепочки неподвижных овальных опор. Поверхность спор гладкая, спороносцы прямые. На крахмало-аммиачной среде образует мелкие вросшие колонии; воздушный мицелий (ВМ) белого цвета, развит незначительно, субстратный (СМ) - грязно-желтоватый, меланоидный пигмент (МП) не образуется. На мясо-пептонном агаре - колонии слабо-вросшие, кожистые, без пигмента и без ВМ, СМ - светло-грязно-желтый, МП не выражен. На овсяном агаре обильный рост. ВМ - белый, при созревании - серо-сизый, СМ - бурый, МП - светло-бурый. В жидкой питательной среде образует мелкие округлые, хлопьевидные образования.

Физиологические и биохимические: аэроб, температурный оптимум 28 - 30^oC, pH среды - 7,0 - 7,2. Культура интенсивно ферментирует глюкозу, мальтозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рамзону, галактозу, маннит, слабо - инозит, сахарозу, не ферментирует сорбит; восстанавливает нитраты, не выделяет индол, амилазоположителен. Не обладает антагонизмом к E. coli, S.aureus.

Устойчивость к антибиотикам: высокочувствителен к стрептомицину, эритромицину, сульфатиазолу, гентамицину; устойчив к левомицетину, пенициллину, оксациллину, полимиксину, ристомицину, линкомицину, карбенициллину.

Штамм хранится в лиофильном состоянии и в питательной среде под слоем вазелинового масла. Для культивирования Streptomyces sp. применяют среду следующего состава (г/л): рыбный гидролизат - 37, NaCl - 5, вода - остальное, pH 7,2. Культивирование проводят при 30^oC с интенсивной аэрацией в течение 48 час. Выход целевого фермента 50000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 50000 ед/мл, что в несколько раз выше, чем в прототипе.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является:
- высокая продуктивность штамма, превышающая по данному показателю штамм-прототип,
- высокая стабильность фермента (сохранение активности в течение двух лет хранения при - 20^oC),
- термостабильность фермента, в результате чего сокращается процесс выделения.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-CTGCAG-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Ssp12-I (дор. 1) и PstI ("СибЭнзим", сайт узнавания 5'-CTGCAG-3'), (дор. 2), PstI и Ssp12-I (дор.3).

Как видно из представленной фигуры, индентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 30^oC. После 10 ч инкубации подросшие клетки пересевают в колбы с питательной средой, содержащей следующие компоненты (г/л): рыбный гидролизат - 37, NaCl - 5, вода дистиллированная - остальное. Культивирование проводят при 30^oC с аэрацией, при перемешивании - 250 об/мин. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4 - 5^oC. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводят по методике [4] с модификацией [5].

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (см. чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1 - 3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-CTGCAG-3'.

Выход фермента определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37^oC. Выход фермента составляет 50000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 50000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^oC в глицерине.

Пример 3. Определение термоустойчивости фермента.

Гидролиз ДНК фага лямбда проводят в стандартных условиях, но при температуре 50^oC. Фермент сохраняет свою активность в данных условиях, что подтверждает его термостабильность (таблица 1).

Гидролиз проводят в стандартных условиях в течение 60 мин.

Пример 4. Определение активности фермента в зависимости от времени хранения при -20^oC. Определение активности проводят в стандартных условиях периодически в течение двух лет хранения рестриктазы (таблица 2). Поскольку рестриктаза имеет сайт узнавания 5'-CTGCAG-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Sal PI, она может заменить прототип во всех генноинженерных работах.

Список литературы
1. Smith D.I. et al (1976) Nucl. Acids Res 3: 343-353.

2. Lebenka A.Y., Chitavichyus D.B. (1988) Biokhimia 53: 1895 - 1899.

3. Carter, J.A., Chater, K.F., Bruton, C.J., Brown, N.L. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4943-4954.

4. Green P. J. et al (1978) Nucleic Acids Res. 5: 2373-2380.

5. Авторское свидетельство СССР N 1406159, 1988.1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть применено в генной инженерии. Штамм Streptomyces sp. ST-12 - продуцент рестриктазы Ssp 12 - 1, выделенный из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз. Обеспечивает получение рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5' - CTGCAG - 3'. Выход фермента составляет 50000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 50000 ед /мл. Рестриктаза Ssp 12 - 1 является изошизомером рестриктазы Sa/PI и может заменить последнюю во всех генноинженерных работах. 1 ил., 2 табл.

Штамм бактерий Streptomyces sp. ST-12 НИИ ККМ В-679 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5^'-CTGCAG-3^'.