ШТАММ БАКТЕРИИ Paenibacillus sp., ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Psp1009I Российский патент 2008 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к поиску новых штаммов-продуцентов биологически активных веществ, перспективных для микробиологической промышленности и генной инженерии, и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC-3'.

В процессе анализа образцов почвы Долины Гейзеров (Камчатка) была выделена бактерия рода Paenibacillus, являющаяся продуцентом эндонуклеазы рестрикции, названной Psp 1009l согласно общепринятой номенклатуре [1]. Штамм культивируется при температуре 28-30°С и является продуцентом эндонуклеазы, обладающей высокой активностью при температуре 37°С. Фермент является изошизомером известного фермента BglI, который был впервые выделен в 1976 г. из штамма Bacillus globigii [2].

Известны другие прототипы этого фермента: Bpu 86I из штамма Bacillus pumilis 86 и Bse 631I из штамма В.species 631 [3]. BsoJI из штамма Bacillus stearothermophilus Azores9582A_[4]. Tsp 219I из штамма Thermus species_[5]. Tsp 8EI из штамма Thermus species 8E [6]. VanI из штамма Vibrio anguillarum [7].

Однако в штаммах рода Paenibacillus эндонуклеаза рестрикции с такой специфичностью выделена впервые.

Данный штамм содержит только один фермент, что является его преимуществом перед Bacillus species 6-3-1 [3] и Thermus species 8E [6], которые содержат по две эндонуклеазы разной специфичности.

Штамм хорошо растет на простых питательных средах и не относится к патогенным штаммам. Выход биомассы составляет 5,5±0,5 г/л L-бульона. А выход фермента - 30000 Е/г.

Эндонуклеаза рестрикции данной специфичности используется для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов и ранее не обнаружена в штаммах рода Paenibacillus.

В литературе не приводятся данные о выходе ферментов для большинства прототипов Psp1009I.

Наиболее доступным и близким к заявляемому штамму является штамм Bacillus globigii, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции BglI [3, 5], прототип. Фермент сохраняет активность от двух до шести месяцев хранения при -20°С.Данных по выходу фермента не обнаружено.

Технической задачей изобретения является получение штамма, способного расти на простых питательных средах, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-GCCNNNN/NGGC-3', с высоким выходом фермента, стабильного при хранении и способного проявлять активность при низкотемпературных условиях реакции.

Поставленная техническая задача решается выявлением и использованием штамма-продуцента сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции Psp1009I.

В процессе изучения свойств данного штамма было установлено, что он относится к роду Paenibacillus.

Идентификацию проводят общепринятыми методами [9-10]. Штамм обладает следующими свойствами:

Грамотрицательный, мезофильный, образует эндоспоры. На плотной питательной среде образует расползающиеся, плоские колонии неправильной формы, со сложной структурой поверхности. Клетки штамма Paenibacillus species Dg-1009 представляют аэробные, грамотрицательные, подвижные правильные палочки, размножающиеся бинарным делением; образуют эллиптические вздутые эндоспоры, расположенные терминально. Размеры клеток штамма находятся в пределах 0,4-0,6×2-3,5 мкм. Штамм Р.species Dg-1009 положителен в тестах на оксидазу, каталазу, эскулин, в реакциях VP и MR, на Н₂S, восстанавливает нитраты; не имеет лецитиназы и липазы, фосфатазы, не гидролизует казеин, отрицателен в тестах на фенилаланиндезаминазу, аргининдекарбоксилазу; не утилизирует цитрат, не образует индол; гидролизует эскулин, арабинозу, ксилозу, глюкозу, сахарозу, лактозу и мальтозу, не утилизирует рамнозу и маннит. Нуклеотидный состав хромосомной ДНК составляет 49.6 мол.% ГЦ.

Основываясь на полученных данных, выделенный штамм относят к роду Paenibacillus.

Полученный штамм депонирован в музее культур ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1092, а продуцируемая им эндонуклеаза рестрикции названа Psp1009I.

Штамм хранится в питательной среде с глицерином.

Для культивирования применяют среду следующего состава (г/л): бакто-триптон (Difco) - 10.0, дрожжевой экстракт (Difco) - 5.0, NaCl - 5.0, рН 7.0-7.2.

Для получения препарата фермента штамм выращивают в пол-литровых колбах в качалке при 200 об/мин и температуре 30°С в течение 24-48 ч. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре 4-5°С. Выделение проводят путем хроматографической очистки на фосфоцеллюлозе Р-11 ("Whatman", Англия). Все операции по выделению Psp1009I проводят при температуре 4-5°С. Клетки суспендируют в буфере А (10 мМ калий фосфатный буфер рН 7.5, 7 мМ β - меркаптоэтанол, 0.1 мМ ЭДТА) из расчета 4 мл на 1 г биомассы и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе ("MSE", Англия), затем осветляют центрифугированием на центрифуге J-21B ("Bekman", США) со скоростью 18000 об/мин в течение 30 мин. Экстракт наносят на колонку (1.6×14 см) фосфоцеллюлозы Р-11 ("Whatman", Англия), промывают буфером А и смывают фермент в градиенте концентрации NaCl (0.0-0.8 М). Фракции, содержащие рестриктазу, диализуют против буфера В (10 мМ трис - HCl рН 7,5, 1 мМ β - меркаптоэтанол, 0.1 мМ ЭДТА. Фракции с ферментом диализуют против 50%-ного раствора глицерина в буфере А.

Для электрофореза используют агарозу фирмы ("Sigma", США). Рестрикционный анализ проводят в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис рН 7.5, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол (ДТТ) и 1 мкг ДНК λсI857 при температуре 25-30°С.

Выход фермента из 1 г клеток составляет 30000 ед.акт. За единицу активности (Е) принимают минимальное количество фермента, которое в течение 1 ч при температуре 30°С в оптимальных условиях полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага λсI857.

Штамм является уникальным не только по наличию данной эндонуклеазы рестрикции, но и имеет дополнительные свойства. Он относится к грамотрицательным бациллам.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является:

- штамм относится к роду Paenibacillus;

- рост на простых питательных средах с добавлением дрожжевого экстракта;

- наличие одного фермента Psp1009I.

В результате скрининга в штамме Paenibacillus sp.Dg1009 была обнаружена эндонуклеаза рестрикции Psp1009I.

Для определения узнаваемой последовательности нуклеотидов эндонуклеазой рестрикции Psp1009I проводят сравнение экспериментально полученных путем электрофореза в агарозном геле фрагментов, образующихся при гидролизе ДНК λcI857, T7, pBR322, pUC19, с контрольными (фиг.1, 2). Результаты сравнительного анализа позволяют сделать вывод, что данная рестриктаза узнает последовательность нуклеотидов (5'-GCCN₅GGC-3'). На фиг.3 представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага λсI857 ферментом Bsp1009I дор.1), BglI и Psp1009I (дор.2) и BglI, сайт узнавания (5'-GCCN₅GGC-3'), (дор.3). Как видно из представленной фигуры, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

Для определения узнаваемой последовательности нуклеотидов эндонуклеазой рестрикции Psp1009I (фиг.1) проводят сравнение экспериментально полученных путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле фрагментов, образующихся при гидролизе ДНК фага λсI857. Результаты сравнительного анализа позволяют сделать вывод, что данная эндонуклеаза рестрикции узнает последовательность нуклеотидов (5'-GCCNNNNNGGC-3'). Как видно из представленной фиг.3, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

Интерпретация полученных экспериментальных данных позволяет утверждать, что исследуемая эндонуклеаза рестрикции является изошизомером рестриктазы BglI.

Таким образом впервые выделена высокоактивная эндонуклеаза рестрикции, узнающая и расщепляющая последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC-3', из штамма, относящегося к роду Paenibacillus, имеющая оптимальную температуру рестрикции 20-30°С.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и никогда не использовался в качестве продуцента эндонуклеазы рестрикции, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Описание фигур:

Фиг.1 - идентификация эндонуклеазы рестрикции из штамма Р.species. Dg1009.

1-BglI/λ, 3-BglII/λ5-HindIII/λ, 7-BssT1I/λ; 2, 4, 6 - разные варианты клеточного экстракта штамма Р.species. Dg1009.

Фиг.2 - электрофореграмма гидролиза различных ДНК клеточным экстрактом штамма Paenibacillus sp.Dg-1009:

1 - ДНК λ, 2 - λ+Psp1009I, 3 - T7+Psp1009I, 4 - ДНК Т7, 5 - pUC19, 6 - pUC19+Psp1009I, 7 - pBR322, 8 - pBR322+Psp1009I.

Фиг.3 - электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага λсI857 ферментом Psp1009I (дор.1), BglI (сайт узнавания 5'-GCCNNNNNGGC-3') (дор.2). Psp1009I и BglI (дор.3).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Анализ штамма на наличие эндонуклеаз рестрикции. Отдельные колонии отбирают с плотной среды и вносят их в 200 мкл TEN буфера (0.1М трис рН 7.5, 0.01М ЕДТА, 0.05М NaCl). Для разрушения используют лизоцим и тритон Х-100. Клеточную суспензию центрифугируют, отбирают аликвоты и вносят их в соотношении 1:10 в инкубационную смесь, содержащую 1 мкг ДНК. Выделенным ферментом проведен гидролиз нескольких субстратов: ДНК фагов λ и Т7 и плазмидных ДНК pBR322 pUC19. Данные представлены на фиг.2.

Пример 2. Получение биомассы и выделение фермента. Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду с дрожжевым экстрактом или РПА (рыбный питательный агар). Косяки помещают в термостат при температуре 28±2°С.После 18 ч инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой,

Культивирование проводят на качалке при 28±2°С с аэрацией, при перемешивании - 200 об/мин 24 часа. Клетки собирают центрифугированием на центрифуге J-21 при 5000 об/мин и температуре 4-5°С. Урожай биомассы составляет 5 г/л среды.

Дезинтеграцию, выделение и очистку фермента проводят по описанной выше методике.

Пример 3. Определение специфичности фермента. Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза ДНК фага лямбда (фиг.3). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC-3'.

Список использованной литературы

1. Smith, Н.О., Nathans, D. // J. Mol. Biol. 1973. V.81. Р.419-423.

2. Pirrotta V. Two restriction endonucleases from Bacillus globigii.. // Nucleic Acids Res. 3: 1747-1760 (1976).

3. В.Е.Репин, Л.Р.Лебедев, И.С.Андреева, Л.И.Пучкова, Ю.П.Зернов, Г.Д.Серов, Т.А.Терещенко, Г.Н.Афиногенова, Н.М.Пустошилова. Продуценты эндонуклеаз рестрикции среди природных микробных изолятов и разработка на их основе технологий получения ферментных препаратов. // Биотехнология, 1998, №2, С.18-27.

4. Jones, S., Hill, V.J., Vincent, S., Clark, D.R. Unpublished observations.

5. Korpela, J., Hjorleifsdottir, S. Unpublished observations.

6. Welch, S.G., Williams, R.A.D. Two thermostable type II restriction endonucleases from Icelandic strains of the genus Thermus: Tsp4C I (ACN/GT), a novel type II restriction endonuclease, and Tsp8E I, an isoschizomer of the mesophilic enzyme Bgll (GCCNNNN/NGGC). // Biochem. J. 309:595-599(1995).

7. Wood, Unpublished observations.

8. Roberts, R.J., Macelis, D. // Nucleic Acids Res. - 2000. - V.28. - P.306-307.

9. Пучкова Л.И., Ушакова Т.А., В.Е.Репин. Тестирование и выделение высокоочищенных эндонуклеаз рестрикции. // Прикладная биохимия и микробиол., 2002, т.38, №1, с.20-24.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

Изобретение относится к области микробиологии и генной инженерии. Получен новый штамм Paenibacillus sp., продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции Psp 1009l, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC-3'. Штамм может быть использован для продукции высокоактивной эндонуклеазы Psp1009l. 3 ил.

Штамм бактерии Paenibacillus sp., депонированный в Коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под №В-1135, продуцент эндонуклеазы рестрикции Psp 1009I.