СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ АУТОАНТИТЕЛ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам диагностики аутоиммунных заболеваний и может быть использовано в ветеринарии, птицеводстве и медицине.

В настоящее время наиболее быстрыми надежными методами диагностики аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка, являются иммунологические методы, основанные на определении присутствия в крови свободных аутоантител (САТ).

В настоящее время для иммунодиагностики используют, как правило, иммуоферментный анализ (ИФА), а также способы, основанные на иммунодиффузии, иммуноэлектрофорезе, иммунофлуоресценции, и ряд других, в основе которых лежит взаимодействие антиген - антитело [1].

Вместе с тем, для определения свободных антител наиболее быстрый и эффективный метод - ИФА - не пригоден, т.к. основывается на взаимодействии с ними иммуновидовых конъюгатов к иммуноглобулинам исследуемого организма, которые способны реагировать как с образовавшимися иммунными комплексами антиген - антитело, так и отдельными антителами и антигенами. Применение метода по существующей схеме тем самым независимо от факта наличия или отсутствия САТ дает положительную реакцию.

Остальные из вышеупомянутых методов трудоемки и недостаточно чувствительны (предел обнаружения 100-1000 нг белка/мл).

Прототипом заявляемого изобретения является основной метод, используемый в практике для определения САТ, метод непрямой гемагглютинации [2].

Метод заключается в том, что отбирается и измельчается орган больного животного, после чего общепринятыми методами выделяют белки, содержащие антиген, который затем прикрепляют к эритроцитам барана общепринятыми методами и ставят реакцию (РНГА) с исследуемой сывороткой крови. Наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов определяют визуально.

Недостатком метода является длительность (от нескольких часов до нескольких суток) и недостаточная точность.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлась разработка более быстрого и точного метода диагностики свободных САТ.

Было найдено, что задача может быть решена при замене метода агглютинации (РНГА) на отдельные элементы иммуноферментного анализа (ИФА) с их определенной модификацией.

Полученный в итоге способ отличается от прототипа тем, что антиген из сыворотки предварительно иммобилизуют на носитель (планшет для ИФА, фильтр, латекс и т.п.), а после контакта с исследуемой жидкостью образовавшийся комплекс отмывают от остатков сыворотки и обрабатывают конъюгатом белка A стафилококка с одним из следующих ферментов: пероксидазой хрена, глюкооксидазой, D- β -галактозидазой или щелочной фосфотазой.

Оптимальное соотношение комплекс:конъюгат - 1:0,46.

Для достижения более высокой точности сыворотку, содержащую антиген, целесообразно получать гомогенизацией органов больных животных с симптомами дистрофии с последующей экстракцией целевых белков фосфатным буфером, осветлением полученного раствора и осаждением из него белков, которые затем обрабатывают белком A стафилококка, например, пропусканием раствора белков через колонку, содержащую белок A.

В результате проведения анализа по заявляемой схеме удалось уменьшить срок анализа до 0,5 ч и повысить его точность в 10-100 раз.

Промышленная применимость метода иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 100 г патологически измененной селезенки, полученной от цыплят, имеющих признаки дистрофии, растирали в ступке с кварцевым песком или битым стеклом до получения гомогенной массы. Затем продукт заливали 10-кратным объемом 0,15 М фосфатного буфера и перемешивали на магнитной мешалке 1 ч при комнатной температуре.

Взвесь отделяли центрифугированием при 6000 об/мин 30 мин. К супернатанту добавляли 20% раствор ПЭГ-6000 (или (NH₄)₂SO₄) до концентрации в растворе 2-2,5% и осуществляли инкубацию при 20^oC 20-40 мин. Осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об/мин. В полученный супернатант добавляли ПЭГ-6000 или (NH₄)₂SO₄ до концентрации 6% и выдерживали при 20^oC 20-40 мин, после чего отделяли осадок центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 20 объемах фосфатного буфера, после чего раствор пропускали со скоростью 0,1^-1 через колонку, содержащую белок A Staphilococcus aureus. Раствор очищенного антигена конъюгировали на носитель (планшетка, фильтр) и вакцинировали. Исследуемую сыворотку помещали на носитель с антигеном. Через 10 мин носитель промывали в буфере и на него помещали конъюгат белка с ферментом. Затем еще раз промывали и проявляли результат реакции.

Пример 2. В условиях примера 1 проводили анализы содержания САТ у цыплят разного возраста. Полученные результаты приведены в табл. 1. Как видно из приведенных данных, заявляемый способ существенно надежнее и точнее, чем прототип.

Пример 3. В условиях примера 1 проводили опыты с различными антигенами. Полученные результаты приведены в табл. 2.

Как видно из данных, заявляемый способ существенно надежнее и точнее, чем прототип.

Литература.

1. Иммунологические методы. /Под ред. Г. Фримеля, - М.: Медицина, 1987, с. 472.

2. Там же, с. 211-213.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: с целью диагностики аутоиммунных заболеваний до взаимодействия с антителами антиген иммобилизуют на носитель, комплекс антиген - антитело отмывают от остатков сыворотки и обрабатывают конъюгатом белка А стафилококка с ферментом. В качестве фермента используют пероксидазу, глюкозооксидазу, D - β - галактозидазу или щелочную фосфотазу. Оптимальное соотношение комплекс: конъюгат - 1 : 0,46. Для получения антигена используют органы животных с синдромами дистрофии, которые измельчают, гомогенизируют, экстрагируют целевой белок фосфатным буфером, раствор осветляют, осаждают белки, которые затем обрабатывают белком А стафилококка. 6 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ определения свободных аутоиммунных антител, включающий выделение белков, содержащих антиген, введение антигена в контакт с антителами крови исследуемого организма и проявление образовавшегося комплекта, отличающийся тем, что до взаимодействия с антителами антиген иммобилизуют на носитель, а после осуществления реакции образовавшийся комплекс антиген - антитело отмывают от остатков сыворотки и обрабатывают конъюгатом белка А стафилококка с ферментом. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фермента в конъюгате используют пероксидазу. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фермента в конъюгате используют глюкозооксидазу. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фермента в конъюгате используют D-β-галактозидазу. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фермента в конъюгате используют щелочную фосфотазу. 6. Способ по пп.1 - 5, отличающийся тем, что обработку комплекса антиген - антитело конъюгатом проводят при соотношении от 1 : 1 до 1 : 0,46 по белку. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения антигена используют органы животных с синдромами дистрофии, которые измельчают, гомогенизируют, экстрагируют целевой продукт фосфатным буфером, полученный раствор осветляют, осаждают белки, которые затем обрабатывают белком А стафилококка.