СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКЦИИ ПРОТЕИНА С (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1998 года по МПК C12N15/06 C12P21/02 

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам продуцирования высоких уровней функционального рекомбинантного протеина C в клеточных линиях млекопитающих.

Многие протеины подвергаются значительной пост-трансляционной модификации в процессе созревания. Человеческий протеин C (ЧПС) (human protein C - HPC, пер. ) гамма-карбоксилируется, бета-карбоксилируется и гликозилируется либо в процессе, либо сразу после трансляции первичной РНК матрицы. Многие линии клеток, такие как клеточная линия AV12 сирийского хомяка, являются неспособными эффективно осуществлять эти пост-трансляционные модификации, поэтому молекулы протеина C, продуцированные в этих клетках, не полностью функциональны. Другие линии клеток, такие как клеточная линия 293 человеческой почки, продуцируют полностью функциональные молекулы протеина C, но уровни экспрессии молекул протеина C в этих клетках являются довольно низкими. Настоящее изобретение относится к способам повышения уровня продуцирования полностью функционального протеина C в таких клеточных линиях, которые обычно не продуцируют полностью функциональные молекулы. Изобретение также относится к способам повышения уровня общего продуцирования молекул протеина C в таких клеточных линиях, которые обычно продуцируют полностью функциональные молекулы. Способы по настоящему изобретению касаются культивирования продуцирующих протеин C клеточных линий при температурах, более высоких, чем обычная температура инкубации 37^oC.

В соответствии с настоящим изобретением определены ниже следующие термины.

Аденовирус-трансформированная клеточная линия -линия клеток, которая производит ElA-генный продукт аденовируса.

Человеческий протеин C - зимоген человеческого протеина C и активированный человеческий протеин C.

Насцентный протеин - полипептид, продуцируемый при трансляции мРНК, до каких-либо пост/трансляционных модификаций. Однако пост-трансляционные модификации, такие как гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспарагиновой кислоты, могут начинать происходить перед тем, как протеин полностью транслирован с транкрипта сРНК.

Активность протеина C - любое свойство человеческого протеина C, отвечающее за протеолитическую, амидолитическую, эфиролитическую и биологическую (антикоагулянтную или профибринолитическую) активности. Способы определения протеин-антикоагулирующей активности хорошо известны специалистам, см. Grinnell et., 1987, Bio/Techology 5:1189-1192.

Зимоген - биокаталитически неактивный предшественник протеолитического фермента. Зимоген протеина C, используемый здесь, относится к секреторным, неактивным формам, либо одной цепи, либо двух цепей протеина C.

Все аббревиатуры аминокислот, используемые в этом описании, такие же, как и в Патенте Соединенных Штатов и Trademark Office, представленные в 37 C.F.R. I.822 (b) (2) (1990).

Наиболее близким к заявленному является способ экспрессии белка C (EP, N 0266190, C 12 N 15/00, 1988), предусматривающий культивирование рекомбинантной клетки 293 человеческой почки.

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования протеина C в аденовирус-трансформированных рекомбинантных хозяйских клетках млекопитающих. Способ включает культивирование аденовирус-трансформированных рекомбинантных хозяйских клеток млекопитающих при температуре между 38^oC и 39^oC. Изобретение относится также к способу повышения продуцирования функционального протеина C в аденовирус-трансформированных рекомбинантных хозяйских клетках млекопитающих, включающему культивирование клетки хозяина при температуре между 38^oC и 39^oC.

Для продуцирования рекомбинантного человеческого протеина C использовались многие различные клеточные линии. Однако поскольку молекула человеческого протеина C подвергается значительной пост-трансляционной модификации, наиболее общепринятые клеточные линии или не продуцируют полностью функциональный протеин C, или, если полностью функциональный протеин C продуцирован клеточной линией, уровень экспрессии или секреции остается относительно низким. Например, клеточная линия AV12 сирийского хомяка обычно не может продуцировать молекулы протеина C, которые содержат все девять остатков гамма-карбокси глутаминовой кислоты, требуемых для полной активности. С другой стороны, молекулы протеина C, продуцированные в клетках 293 почки эмбриона человека, являются, главным образом, полностью гамма-карбоксилированными и бета-гидроксилированными, хотя уровни продуцирования человеческого протеина C этими клеточными линиями относительно низкие.

Обычно культуры клеток млекопитающих инкубируют при 37^oC. Когда аденовирус-трансформированную клеточную линию AV12-664 сирийского хомяка (ATCC CRL 9595), содержащую плазмиду, кодирующую ген человеческого протеина C, инкубируют при 37^oC, клеточная линия продуцирует протеин C, который гамма-карбоксилирован только на 40 - 50%, что приводит к низкой функциональности протеина C в неочищенной культурной среде. Когда эту же самую клеточную линию инкубируют при температуре 38,5^oC - 39^oC, функционально-антикоагулянтная активность секретированного протеина C в кондиционированной культурной среде увеличивается. Скорость секреции протеина C из этой клеточной линии, инкубированной при повышенной температуре, была на 20-30% ниже, чем скорость секреции при 37^oC, хотя это понижение скорости секреции компенсировалось повышением функциональности секретированного протеина C.

Клетки 293 человеческой почки (ATCC CRL 1573) являются трансформированными первичными клетками почки эмбриона человека, которые содержат и экспрессируют трансформирующей ген аденовируса 5. Эти клетки были использованы для экспрессии некоторых важных генных продуктов и применялись рядом различных лабораторий как в научных учреждениях, так и в промышленности. Например, Yan, U. S. Patent No. 4981952 и Bang et al., U. S. Patent No. 4992373 описывают использование клеточной линии 293 для продуцирования человеческого протеина C. Клеточная линия 293 почки эмбриона человека секретирует полностью гамма-карбоксилированный человеческий протеин C, когда несет экспрессирующую плазмиду, кодирующую ген человеческого протеина C. Культивированная при 37^oC эта линия клеток 293 секретировала человеческий протеин C со специфической активностью приблизительно 350 U/мг. Повышение температуры роста этих рекомбинантных клеток 293 не приводит к повышению функциональности секретированного протеина C (так как протеин C из этой клеточной линии уже полностью гамма-карбоксилирован). Однако, рекомбинантные клетки 293, выращенные при 38^oC - 39^oC, показывают повышение скорости секреции протеина C по сравнению с теми же клетками, выращенными при 37^oC. В соответствии с настоящим изобретением повышение продуцирования протеина C может означать либо повышение в целом секреции протеина C из клеточной линии, либо повышение функциональности секретированного протеина C.

Специалисту ясно, что настоящее изобретение не ограничено использованием аденовирус-трансформированной клеточной линии почти эмбриона человека или аденовирус-трансформированной клеточной линии AV-12-664 сирийского хомяка. Большое число клеточных линий млекопитающих способно продуцировать человеческий протеин C. Например, клеточная линия HepG2 является линией клеток печени человека, которая была использована для продуцирования человеческого протеина C. Клеточная линия ВНК (Baby Hamster Kidney - почка детеныша хомяка), клеточная линия SA7, клеточная линия SV20, клеточная линия FAZA и клеточная линия МК2 были также использованы для продуцирования протеина C. Хотя не все перечисленные клеточные линии являются аденовирус-трансформированными клеточными линиями, специалисту понятно, что многие клеточные линии млекопитающих могут быть трансформированы аденовирусом для создания специфической аденовирус-трансформированной линии клеток, которая может быть использована в способе по настоящему изобретению.

Необходимо также учесть, что настоящее изобретение не ограничивается только температурами 38^oC и 39^oC. Большинство ферментативных процессов у млекопитающих протекает при 37^oC, хотя было обнаружено, что температура ферментации около 38^oC приводит к повышенному продуцированию протеина C в аденовирус-трансформированных клетках. При том, что во многих ферментерах и термостатах температуры могут колебаться на 0,5^oC, термин "около" может рассматриваться как температура в пределах 0,5^oC от исходной температуры. Поэтому термин "около" 38^oC может подразумевать от 37,5^oC до 38,5^oC. Далее, термин "около" 39^oC может подразумевать от 38,5^oC до 39,5^oC. Большинство клеток млекопитающих не выращиваются при температуре инкубирования выше около 40^oC. Предпочтительные температуры способа настоящего изобретения колеблются от около 38^oC до около 39^oC, тогда как наиболее предпочтительное осуществление настоящего изобретения включает температуру инкубирования аденовирус-трансформированной клеточной линии при около 39^oC.

Специалисту также понятно, что способ настоящего изобретения позволит более легко отобрать такие клоны, которые экспрессируют высокие уровни протеина C. Например, так как уровень протеина C, секретируемого из клеточной линии, повышен, легче исследовать молекулу в неочищенной среде, следовательно, легче отобрать клон, который экспрессирует самый высокий уровень желаемого продукта. Среднее увеличение в уровнях экспрессии для кланов, выделенных при 39^oC, колеблется от около 69% до 93% по сравнению с клонами, выделенными при 37^oC.

Следующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения, но не для его ограничения.

Пример 1.

Продуцирование человеческого протеина C в клетках 293
Рекомбинантный человеческий протеин C (pЧПС, Recombinant human protein C - rHPC) был продуцирован клетками 293 человеческой почки методом, хорошо известным специалистам, подобным методу Yan, U. S. Patent N 4981952. Генный закодированный человеческий протеин C описан и заявлен Bang et al., U. S. Patent N 4775624. Плазмида, используемая для экспрессии человеческого протеина C в клетках 293, была плазмидой pLPC, которая описана Bang et al., U. S. Patent N 4992373. Строение плазмиды pLPC описано также в Европейской патентной публикации No. 0445939 и Geinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192. Коротко говоря, плазмида pLPC была трансфецирована в клетки 293, затем стабильные трансформанты идентифицируют и субкультивируют. Клоны, демонстрирующие наиболее высокий уровень экспрессии, дали различные обозначения (например CC35 и CC31-1) и выращены при стандартных для клеточной культуры условиях. Альтернативно, плазмида pGTC была использована для создания стабильно-трансформированной клеточной линии GT-21. Строение плазмиды pGTC было описано в Европейской патентной публикации N 445939. После выращивания при 37^oC человеческий протеин C может быть отделен от культуральной жидкости методом Yan, U. S. Patent N 4981952. Человеческий протеин C, полученный таким образом, может быть использован в неактивированной зимогенной форме или может быть активирован способами, хорошо известными специалистам. Те же самые клоны могут быть также выращены при тех же условиях при 39^oC. Результаты представлены в табл. 1.

Даже тогда, когда клетки выращены при различных плотностях клеток, что приводит к получению различных уровней экспрессии для клетки (например, CC35), постоянно наблюдалось увеличение процента секреции при 39^oC.

Пример 2.

Продуцирование человеческого протеина C в клетках AV12-664
Человеческий протеин C был продуцирован с использованием плазмиды pLPC в соответствии с методиками примера 1, за исключением того, что клетки AV-664 сирийского хомяка были использованы вместо клеток 293 почки эмбриона человека. Функциональная антикоагулянтная активность измерялась способами Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192. Результаты представлены в табл. 2.

Цель изобретения: способ продуцирования высоких уровней функциональных рекомбинантных протеинов в аценовирус-трансформированных клетках млекопитающих. Сущность изобретения: способ дает более высокие уровни экспрессии общего протеина в клеточной линии 293 человеческой почки и более высокие уровни функционального протеина в клеточной линии AV12 сирийского хомяка. Проводят культивирование клеточной линии 293 или AV12, трансформированной рекомбинантным вектором экспрессии, содержащим фрагмент последовательности ДНК, кодирующий целевой продукт, при температуре 38 - 39^oC. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ повышения продукции гамма-карбоксилированного рекомбинантного протеина С, предусматривающий культивирование клеточной линии 293 (человеческой почки), трансформированной рекомбинантным вектором экспрессии, содержащим фрагмент последовательности ДНК, кодирующий целевой продукт, отличающийся тем, что культивирование ведут при 38 - 39^oС. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что температура культивирования составляет около 38^oС. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что температура культивирования составляет около 39^oС. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что температура культивирования составляет около 38,5^oС. 5. Способ повышения продукции гамма-карбоксилированного рекомбинантного протеина С, предусматривающий культивирование хозяйских клеток млекопитающего, трансформированных рекомбинантным вектором экспрессии, содержащим фрагмент последовательности ДНК, кодирующий целевой продукт, отличающийся тем, что в качестве хозяйских клеток используют клетки линии AV12, а культивирование ведут при температуре 38 - 39^oС. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что рекомбинантную хозяйскую клетку AV12 культивируют при температуре около 38^oС. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что рекомбинантную хозяйскую клетку AV12 культивируют при температуре около 39^oС.