ПРОИЗВОДНОЕ БЕЛКА С ЧЕЛОВЕКА И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТИТРОМБИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1998 года по МПК C07K14/745 C12N15/12 A61K38/36 A61K47/42 

Настоящее изобретение относится к области человеческой медицины, конкретно к лечению нарушений свертываемости крови. Наиболее точно изобретение относится к производным от молекулы человеческого протеина C, способам использования этих производных и фармацевтическим композициям, включающим эти производные протеина C.

Протеин C является протеином плазмы, зависимым от витамина K, который циркулирует главным образом в виде неактивного гетеродимера с дисульфидной связью, состоящего из легкой цепи в 25 килодальтон и тяжелой цепи в примерно 41 килодальтон. Тяжелая цепь содержит домен сериновой протеазы с его N-концевым пептидом активации, тогда как легкая цепь содержит участок остатков гамма-карбоксиглютаминовой кислоты, который необходим для зависимого от кальция связывания с мембраной и для функциональной активности. Зимоген неактивного человеческого протеина C превращается в активированный протеин C путем действия тромбин/тромбомодулинового комплекса, который отщепляет активирующий пептид (остатки 158 по 169 циркулирующего зимогена или остатки 200 по 211 препрозимогена), чтобы образовался активированный протеин C.

Роль протеина C как терапевтического агента хорошо известна (смотрите, например, Bang et. al., патент США N 4775624, который открывает последовательность ДНК, кодирующую зимоген человеческого протеина C, и Bang et.al., патент США N 4 992 373, который раскрывает метод получения активированного человеческого протеина C). Производное человеческого протеина C, обозначенное как FLIN, было открыто Gerlitz et.al в Европейской патентной заявке с серийным номером 91301450.2. Это производное FLIN содержит остаток фен вместо остатка Асп в 167 позиции активирующего пептида (положение 206 препрозимогена) и остаток Асн вместо остатка Асп в позиции 172 в тяжелой цепи (положение 214 препрозимогена). Производное FLIN более легко активируется тромбином, чем зимоген человеческого протеина C дикого типа. Другие производные человеческого протеина C, обозначенные Q313 и Q 329, были раскрыты Gerlitz et.al. в Европейской патентной заявке с серийным N 91301446.0. Производное Q313 содержит Глн остаток вместо остатка Асн в позиции 313 зимогена дикого типа, тогда как производное Q329 содержит Глн остаток вместо Асн остатка в положении 329 зимогена дикого типа. У этих производных Q 313 и Q329 отсутствуют углеводородные структуры в норме связанные с Асн остатком в этих сайтах молекулы дикого типа, и поэтому проявляют повышенную амидолитическую и функциональную активности.

Настоящее изобретение относится к производным человеческого протеина C, модифицированного путем изменения аминокислоты 313 молекулы природного человеческого протеина C с аспарагина на глютамин и заменой аминокислоты 167 молекулы природного человеческого протеина C, аспартовой кислоты на фенилаланин, и заменой аминокислоты 172 молекулы природного человеческого протеина C, аспартовой кислоты на аспарагин. Эти молекулы могут также быть модифицированы в позиции 329 молекулы природного человеческого протеина C путем замены остатка аспарагина дикого типа на глютаминовый остаток. Замена остатка 329 может быть произведена вместе с заменой остатка 313, или может быть также произведена вместе с изменением остатков 167 и 172. Вышеназванные производные человеческого протеина C легче активируются тромбином и к тому же более функционально активны, чем молекула человеческого протеина C или любое другое производное человеческого протеина C.

Также открыты и заявлены конструкции рекомбинантной ДНК, векторы и трансформанты, пригодные для получения новых производных человеческого протеина C. Кроме того, открыты и заявлены фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество производного человеческого протеина C этого изобретения в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых наполнителей, так же как и способы применения производных при лечении и предупреждения болезненных состояний.

Для целей настоящего изобретения, как здесь раскрыто и заявлено, следующим терминам и аббревиатурам дано объяснение ниже.

Q313 - производное человеческого протеина C, где аспарагиновый остаток в положении 313 молекулы природного человеческого протеина C был заменен на глютаминовый остаток.

Q329 - производное человеческого протеина C, где аспарагиновый остаток в положении 329 молекулы человеческого природного протеина C был заменен на глютаминовый остаток. Производные протеина C Q313 и Q329 раскрыты Gerlitz et. al. Европейская патентная заявка серийный N 91301446.0 и Grinnell et.al, 1991, J. Biol. Chem. 226: 9778-9785, сведения о которых включены здесь для справки.

Q309 - производное человеческого протеина C, где аспарагиновый остаток в положении 313 молекулы природного человеческого протеина C был заменен на глютамин в аспарагиновый остаток в положении 329 молекулы природного человеческого протеина C был заменен на глютаминовый остаток.

F167 - производное человеческого протеина C, где остаток аспартовой кислоты в положении 167 молекулы природного человеческого протеина C был заменен на фенилаланин. Производное протеина CF167 раскрыто в Bang et.al. Европейская патентная заявка, серийный N 88312201.2 и у Ehrlich et.al., 1990, EMBO.J.9: 2367 - 2373, сведения о которых включены здесь для справки.

LIN - производное человеческого протеина C, где остаток аспартовой кислоты в положении 172 молекулы природного человеческого протеина C был заменен аспарагиновым остатком.

FLIN - производное человеческого протеина C, где остаток аспартовой кислоты в положении 167 молекулы природного человеческого протеина C был заменен на фенилаланин, и остаток аспартовой кислоты в положении 172 молекулы природного человеческого протеина C был заменен аспарагиновым остатком. Производные LIN и LWN раскрыты у Gerlitz et.al., Европейская патентная заявка, серийный N 91301450.2, и у Grinnell et.al, in Protein C and Related Anticoagulants (eds. Bruley, D. and Drohan W) 13-46 (Gulf Publishing Co, Houston, 1990), сведения о которых здесь включены для справки.

FLIN-Q313 - производное человеческого протеина C, где остаток аспартовой кислоты в положении 167 молекулы природного человеческого протеина C был заменен на фенилаланин, остаток аспартовой кислоты в положении 172 молекулы природного протеина C был заменен на аспарагиновый остаток, и аспарагиновый остаток в положении 313 молекулы природного протеина C был заменен на глютаминовый остаток.

FLIN-Q3Q9 - производное человеческого протеина C, где остаток аспартовой кислоты в положении 167 молекулы природного человеческого протеина C был заменен на фенилаланин, остаток аспартовой кислоты в положении 172 молекулы природного протеина C был заменен на аспарагиновый остаток, аспарагиновый остаток в положении 313 молекулы природного протеина C заменен на глютаминовый остаток, и аспарагиновый остаток в положении 329 молекулы природного протеина C заменен на глютаминовый остаток.

GBMT транскрипционная единица - модифицированная единица транскрипционного контроля, включающая P2 энхансер вируса ВК, расположенный вблизи главного позднего промотора аденовируса 2, перед регуляторным элементом аденовирусного главного позднего промотора (MLTF) - поли-GT-элемент, помещенный чтобы стимулировать вышеназванный промотор, и последовательность ДНК, содержащую сращенную трехчастевую лидерную последовательность аденовируса.

Образующийся протеин - полипептид, образуемый при трансляции транскрипта мРНК, до каких-либо посттрансляционных модификаций. Однако, посттрансляционные модификационные модификации, такие как гамма-карбоксилирование остатка глютаминовой кислоты и гидроксилирование остатка аспартовой кислоты может начинаться до полного завершения трансляции с транскрипта мРНК.

Активность протеина C - любое свойство человеческого протеина C, ответственного за протеолитическую, амидолитическую, этеролитическую и биологическую (антикоагулянтную и профибринолитическую) активность. Методы определения протеиновой антикоагулянтной активности хорошо известны специалистам, например, смотрите Grinnell et.al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192.

Зимоген - энзиматически неактивный предшественник протеолитического фермента. Зимоген протеина C, использованный здесь, относится к секретируемым, неактивным формам, с одной или двумя цепями, протеина C.

Все аббревиатуры аминокислот, использованные в этом описании, приняты в Ведомстве США по патентам и товарным знакам, как изложены в 37 Своде федеральных правил 1.822 (b)(2)(1990).

Настоящее изобретение представляет производные человеческого протеина C, которые имеют измененный тип гликозилирования и измененные области активации. В частности, эти производные включают Q3Q9, FLIN-Q313 и FLIN-Q3Q9. Производное Q3Q9 содержит глютаминовые остатки в положениях 313 и 329 молекулы протеина C (вместо аспарагиновых остатков в норме обнаруживаемых в этих положениях). Производные FLIN-Q313 содержит остаток фенилаланина в положении 167 молекулы и аспарагиновый остаток в положении 172 молекулы (вместо остатков аспартовой кислоты, в норме обнаруживаемых в этих положениях), так же как и остаток глютамина в положении 313 (вместо аспарагинового остатка, в норме обнаруживаемого в этом положении). В производном FLIN-Q3Q9 остаток в положении 167 был заменен с аспартовой кислоты на фенилаланин, остаток в положении 172 заменен с аспартовой кислоты на аспарагин, остаток в положении 313 заменен с аспарагина на глютамин и остаток в положении 329 заменен с аспарагина на глютамин.

Производные FLIN-Q313 и FLIN-Q3Q9 показали исключительно высокие степени активации одним тромбином. Кроме того, оба производных FLIN-Q313 и FLIN-Q3Q9 в отличие от протеина C дикого типа может активироваться в свертывающейся человеческой плазме, давая в результате подавление дальнейшего образования сгустка. Этот активированный сгусток профермент обладает существенно большей специфической активностью и большим полупериодом существования, чем активированная форма природного протеина C. Производные настоящего изобретения поэтому могут быть использованы как сайт-активированные антитромбические агенты, не обладающие антикоагулянтной активностью без присутствия значительной выработки тромбина.

Изобретение также предоставляет последовательности ДНК для получения производных протеина C. Эти образования ДНК включают кодирующую последовательность для легких цепей человеческого протеина C, расположенную за препропептидной последовательностью зимогена протеина C дикого типа, непосредственно примыкая к ней и в одной трансляционной считывающей рамке. Последовательности ДНК также кодируют дипептид Лиз-Арг, который включен в процесс при завершении формирования молекулы протеина C, активации пептида и тяжелой цепи молекулы протеина C. Замены аминокислотных остатков в положениях 167, 172 и 313 изменяют активацию молекулы, тогда как замены аминокислотных остатков в положениях 313 и 329 изменяют содержание углеводородов в молекуле.

Специалисты поймут, что благодаря изменению генетического кода ряд соединений ДНК могут кодировать полипептиды, описанные выше. У Bang et. al, патент США N 4775624Ю дающий наиболее полную информацию, который включен здесь для справки, раскрывается и заявляется последовательность ДНК, кодирующая форму дикого типа молекулы человеческого протеина C. Исходя из этого опытный экспериментатор мог бы легко определить, какие изменения в последовательности ДНК могли бы быть использованы, чтобы создать другие последовательности ДНК, которые могли бы кодировать точно те полипептиды, которые описаны здесь, изобретение не ограничивается теми конкретными последовательностями, описанными примерами. Соответственно структуры, описанные ниже и в сопровождающих примерах по предпочтительным последовательностям ДНК, векторам и трансформантам этого изобретения, просто иллюстрируют, но не ограничивают сферу действия изобретения. Кроме того, замещение Глн вместо Асн в положении 313 и 39 является иллюстративным, но не ограничивает область действия изобретения, так как могут быть использованы другие замены, за исключением Цис и Про.

Все ДНК-соединения настоящего изобретения были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза гена человеческого протеина C. Полученные с помощью мутагенеза кодирующие зимоген молекулы были затем встроены в векторы для экспрессии в эукариотах, так что экспрессия генов зимогена может быть произведена с помощью транскрипционной единицы GBMT. Эти векторы были трансформированы в E. coli K12 AG1 и депонированы в клетки и стали частью устойчивого штамма коллекции культур Северных региональных исследовательских лабораторий в Пеории, Иллинойс 61604, 14 января 1992 г. Специфические культуры и регистрационные номера представлены в таблице 1.

Культуры получены и плазмиды выделены с использованием общепринятых методик и затем могут быть прямо трансфицированы в эукариотические клетки-хозяева для продукции производных человеческого протеина C. Предпочтительно трансфицировать плазмиды в клетки-хозяева, которые экспрессируют продукт ранних генов аденовируса E1A, в которых ген-усилитель BK, находящийся в единицу транскрипционного контроля GBMT, функционирует, усиливая экспрессию наиболее эффективно в присутствии EIA. Единица транскрипционного контроля GBMT более полно описана у Berg et. al., Европейская патентная заявка серийный N 91301451.0, полные сведения о которой включены здесь для справки. Опытные экспериментаторы представляют себе то число клеток-хозяев, которые экспрессируют или которые можно заставить экспрессировать продукт раннего гена крупного ДНК вируса. Наиболее предпочтительной линией клеток для экспрессии производных человеческого протеина C настоящего изобретения является линия клеток человеческой почки 293, как описано у Bang et. al. Патент США N 4992373, полная информация о котором включена здесь для справки. После экспрессии в линии клеток производные выделяют и очищают из супернатанта клеточной культуры путем процедуры, предложенной Jan, патент США N 4981952, полные сведения о котором здесь представлены для справки. ДНК последовательность этого изобретения могут быть синтезированы химически или путем соединения рестрикционных фрагментов, или путем комбинации методик, известных в данной области науки. Устройство для синтеза ДНК доступны и могут быть использованы для создания ДНК соединений настоящего изобретения.

Векторы, иллюстрирующие это изобретение, включают транскрипционную единицу GBMT, помещенную для стимуляции транскрипции кодирующих последовательностей поздним промотором аденовируса. Опытные специалисты поймут, что большое число эукариотических промоторов, генов-усилителей и векторов для экспрессии известны специалистам и могут быть использованы для экспрессии последовательностей ДНК с целью получения производных протеина C настоящего изобретения. Опытные специалисты также представляют себе, что эукариотические экспрессирующие векторы могут функционировать без усиливающего элемента. Ключевой аспект настоящего изобретения состоит не в особенном гене-усилителе или промоторе, использованном, чтобы экспрессировать производные, а скорее в новых последовательностях ДНК и соответствующих протеинах, полученных с этих последовательностей.

Векторы настоящего изобретения могут быть трансформированы и экспрессированы в широком ряде эукариотических, особенно от млекопитающих, клеток-хозяев. Векторы, депонированные в NRRL, все содержат ген, несущий устойчивость к гигромицину. Однако легко могут быть созданы векторы, не содержащие маркера для селекции, и могут быть использованы для выполнения временно необходимых исследований или могут быть котрансформированы в клеточные линии вместе с другими векторами, которые содержат маркеры для отбора. Векторы этого изобретения могут также включать последовательности, которые дают возможность репликации в E/coli, т. к. обычно более эффективно получение плазмидной ДНК в E.coli, чем в других микроорганизмах-хозяевах.

Возможны многие модификации и вариации настоящих иллюстративных ДНК последовательностей и плазмид. Например, изменение генетического кода дает возможность замещения нуклеотидов по всем участкам, кодирующим полипептид, так же как и сигнал прекращения трансляции, без перестройки последовательности, кодирующей кодируемый полипептид. Такие замещаемые последовательности могут быть выведены из известных аминокислотной и ДНК последовательностей человеческого протеина C и могут быть созданы следующими общепринятыми методами синтеза и сайт-направленного мутагенеза. Методы синтеза могут осуществляться в значительной степени в соответствии с процедурами Itakura et. al. , 1977 Science 198:1056 и Crea.et.al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75: 5765. Поэтому настоящее изобретение никак не ограничено последовательностями ДНК и плазмидами, конкретно приведенных в примерах.

Методы активации зимогеновых форм человеческого протеина C до активированных производных человеческого протеина C стары и хорошо известны специалистам. Протеин C может быть активирован одним тромбином, тромбин/тромбомодулиновым комплексом, ядом гадюки Русселла или рядом других средств. Активность производных человеческого протеина C может быть определена после тромбиновой активации или исследованиями общей амидолитической активности или пробами на антикоагулянты. Тромбиновая активация и определения протеина C (амидолитическая и антикоагулянтная пробы) выполняли в соответствии с описаниями Grinnell et. al. 1987, Bio/Technology 5:1187-1192, полные сведения о котором приведены здесь в виде ссылки.

Рекомбинантные производные человеческого протеина C настоящего изобретения применимы для профилактики и лечения широкого ряда приобретенных болезненных состояний, включающих внутрисосудистую коагуляцию, в том числе тромбоз глубоких вен, легочную эмболию, тромбоз периферических артерий, эмболии сердечных или периферических артерий, острый инфаркт миокарда, внезапные тромбозы, нестабильную ишемию, хирургию периферических сосудов, трансплантацию органов и генерализованный тромбогеморрагический синдром. Эти производные протеина C могут также быть эффективно использованы при лечении значительного числа больных с гетерозиготными дефицитами протеина C, проявляющимися в виде рецидивирующего тромбоза глубоких вен, и в случае гомозиготного дефицита протеина C у больных с молниеносной пурпурой. Еще одно терапевтическое показание для активированных производных протеина C это - предупреждение тромбоза глубоких вен и легочной эмболии, которые обычно лечат низкими дозами гепарина.

Производные и активированные аналоги настоящего изобретения могут быть с помощью известных методов использованы для приготовления фармацевтически пригодных композиций, причем производное человеческого протеина C или активированное производное протеина C настоящего изобретения смешивается с фармацевтически приемлемой несущей основой. Подходящие несущие основы и их лекарственные формы, включающие другие протеины человека, например человеческий сывороточный альбумин, описаны, например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed, 1980 Mack PubLishing Co, edited by Osol et.al, которое приведено здесь для справки. Такие композиции будут содержать эффективное количество производного протеина C или активированного аналога вместе с подходящим количеством несущей основы, чтобы получить фармацевтически приемлемые композиции, удобные для эффективного применения для больного. Композиция с производным протеина C может быть введена парентерально или другими путями, чтобы обеспечить поступление в кровь в эффективной форме.

Следующие примеры представлены как средства иллюстрации настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как его ограничения.

Пример 1
Получение производных человеческого протеина C
Векторы для экспрессии настоящего изобретения выделены из клеток E.coli, затем трансформированы в клетки 293, трансформанты были выделены при 37^oC, затем культивировались для получения производных человеческого протеина C в значительном согласии с данными Bang et. al, патент США N 4992373, который приводится в виде ссылки. Производные очищали из супренатанта клеточной культуры в значительном соответствии с указанными Jan, патент США N 4981952, который приводится здесь в виде ссылки.

Пример 2
Антикоагулянтная активность
Полностью активированный протеин C был получен путем активирования материала 10 нМ тромбина в комплексе с растворимым рекомбинатным человеческим тромбомодулином TMD-75, как описано Parkinson et. al, 1990, J. Biol. Chem., 265: 12602-12610, сведения о котором приведены здесь в виде ссылки. Антикоагулянтная активность активированных молекул определялась по времени свертывания с активированным парциальным тромбопластином.

Результаты представлены далее в таблице 2.

Пример 3
Степень активации
Степень активации определяли, используя человеческий тромбин (10 нМ) в реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,1 мг/мл БСА и 3 мМ CaCl₂. Очищенный протеин C как дикого типа, так и производные, присутствовали в реакции активации в концентрациях от 0,81 до 1,61 едМ. Степень активации определяли путем перемещения образцов из смеси реакции активации в разные моменты времени в 96-ячеичную плату и последующим добавлением хромогенного субстрата (S-2366) до конечной концентрации 0,75 мМ, амидолитическую активность определяли по изменению в абсорбции ед/мин при 405 нМ в кинетическом считывающем устройстве для микротитровальных плат (Molecular Devices). Скорость активации определяли путем перевода изменений в OD/мин в количество полученного активированного протеина C, используя специфическую активность, определенную для каждого протеина, и по графику зависимости активации от времени. Количество активированного протеина C, полученного, было менее 10% от общего исходного материала во всех экспериментах. Результаты представлены далее в таблице 3.

Относительную степень активации также определяли с помощью той же системы определения, используя тромбин и тромбомодулин. Использованный тромбомодулин был растворимым тромбомодулином Parkinson et. al, см. выше. Результаты представлены далее в таблице 4.

Пример 4
Антикоагулянтная активность при свертываемости человеческой плазмы
Дикий тип человеческого протеина C и производное FLIN-Q313 добавляли к человеческой плазме в концентрации 20 нМ вместе со стандартным реагентом HeLena APTT и инкубировали в течение 5 минут при 37^oC. Свертывание плазмы инициировалось добавлением CaCl₂ до конечной концентрации 8 мМ и время свертывания регистрировалось. В одновременных экспериментах моноклональные антитела, способные к нейтрализации активности активированного протеина C, добавляли к контрольной плазме и плазме, содержащей зимоген протеина C дикого типа или FLIN-Q313. Результаты представлены в таблице 5.

Уровень свертывающей активности, индуцированной в свертывающейся плазме, определяли как функцию от концентрации человеческого протеина C дикого типа и FLIN-Q313 производного, и данные выражали как удлинение времени свертывания. В основном значении времени свертывания в этом исследовании были в пределах от 27 до 33 секунд. Результаты представлены далее в таблице 6.

Пример 5
Определение относительного полупериода существования
Ингибирование человеческого протеина C в плазме определяли путем инкубирования нормальной человеческой плазмы (цитратной) со 100 нМ активированного человеческого протеина C, активированного FLIN-Q313 или зимогена (неактивированного) FLIN-Q313. Концентрация плазмы при окончательной реакции с остальным объемом, состоящим из буфера, содержащего 3 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис, pH 7,4 и 1 мг/мл БСА, была равна 90% (объем/объем). Через определенные промежутки времени отбирали образцы и определяли активность активированного протеина C по амидолитической активности с использованием S-2366 при окончательной концентрации 1 мМ, или по времени пробы с активированным парциальным тромбопластином. Уровень активности FLIN-Q313, активированного свертыванием, определяли как описано в примере 4. Активированный протеин C и активированный FLIN-Q313, оба показали более чем 50% потерю активности после примерно 25 минут, тогда как зимоген FLIN-Q313 все еще сохранял по крайней мере 80% активности после 45 минут.

Изобретение относится к генной инженерии и медицине. Реализация изобретения позволяет повысить степень активации производного белка С человека. В производном белка С человека остаток аспарагиновой кислоты в положении 167 природного белка С человека замещен фенилаланином. Остаток аспарагиновой кислоты в положении 172 замещен остатком аспарагина. Остаток аспарагина в положении 313 замещен остатком глутамина. Производное белка С человека в эффективном количестве в качестве активного начала вместе с приемлемым растворителем или носителем используют для получения фармкомпозиции. 2 н.з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Производное белка C человека, в котором остаток аспарагиновой кислоты в положении 167 природного белка C человека замещен фенилаланином, остаток аспарагиновой кислоты в положении 172 природного белка C человека замещен остатком аспарагина и остаток аспарагина в положении 313 природного белка C человека замещен остатком глутамина. 2. Фармацевтическая композиция обладающая антитромбическим действием, содержащая производное белка C человека в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый растворитель или носитель, отличающаяся тем, что производное белка C человека представляет собой производное по п.1 в эффективном количестве.