СПОСОБ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПРОРОСТКОВ Российский патент 1998 года по МПК A01C1/02 

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений, может быть применено в молекулярной биологии развития, а именно в исследовании молекулярно-генетических механизмов формирования онтогенетических реакций при развертывании генетических программ развития, определяющих морфогенез и онтогенез при дифференциальном росте растений.

Обычно для биохимического анализа внутриклеточных органелл используются от нескольких десятков до нескольких сотен растущих гетеротрофных проростков. Поэтому остро возникает необходимость создания картирования физиологической оценки популяции семян и растущих проростков с целью получения физиологически однородных клеточных органелл, четко соответствующих физиологическим особенностям растущих проростков [1, 2]. Часто используемые в литературе характеристики типа суточные, двухсуточные и так далее, а также 24-часовые, 48-часовые и так далее, растущие проростки не всегда отражают особенности физиологической оценки популяции семян и проростков, используемых для биохимического анализа. В случае морфологической характеристики физиологических особенностей гетеротрофной фазы развития проростков почему-то делается акцент не на характеристике популяций, используемых для анализа семян, а на характеристике единичных растений.

Известен способ физиологической оценки семян [3], в котором проростки характеризуют с указанием суток после начала набухания (1, 2, 3, 4, 5, 6 и так далее дней).

Недостаток такой характеристики заключается в том, что предлагаемая схема основных физиологических процессов прорастания семян не дает физиологической характеристики популяции семян, отобранных для исследования биохимических процессов, так как наверняка, процессы синтеза белка в первые 24-48 ч прорастания проводились не на одном проростке, а на отработанной популяции проростков).

Цель изобретения - графическое, наглядное изображение в виде карт физиологической оценки популяции семян и растущих проростков с указанием стандартизованных физиологических особенностей популяции проростков, отобранных для биохимического анализа или выделения их внутриклеточных органелл.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Перед обработкой семена были тщательно отобраны от разрушенных семян, взвешены, подсчитано, сколько зерен находится в 1 г семян, исходя из данных, был сделан перерасчет массы на 1 семя (фиг. 1-3). Просеянные через сито диаметром 0,3-0,4 см семена в количестве 200 г в течение 15 с обрабатывали 200 мл 96% спиртом. И сразу в течение часа оставляли промываться в струе проточной водопроводной воды 8-10^oC для удаления мукора (Mucoraceae). Достаточность промывки оценивали микроскопически по исчезновению мукора в сливных водах. Обычно промывку семян всегда начинали в одно и то же время, 10 ч. 30 мин. утра. После часовой промывки семена два раза промывали дистиллированной водой при температуре 22^oC и заливали объемом дистиллированной воды в 600 мл для набухания семян в течение 3 ч при температуре 22^oC. Посев семян также всегда осуществляли в одно и то же время, а именно в 14 ч. 30 мин. Кюветы размером 34 x 28 см, стекла 28 x 23 см и подставки для стекол были подвергнуты стерилизации путем обработки спиртом и прокаливанием с сжиганием остатков спирта. Камера для проращивания проростков также подвергалась стерилизации путем обработки спиртовым ватным тампоном, удаляющим остатки спирта.

Семена высевали из расчета 40 г на кювету, гнездовым методом:
,
на лист фильтровальной бумаги /наслоенной на стекло/, смоченной водой после замачивания семян. Края фильтровальной бумаги опускались в воду эмалированной кюветы. Обычно в кювету вносилось 150 мл дистиллированной воды t - 22^oC и 150 мл воды после 3-часового замачивания семян. Сверху семена покрывались фильтровальной бумагой с 8 отверстиями для аэрации семян. В определенные интервалы времени от начала обработки - замачивания семян, то есть через 24 ч, 48 ч, 78 ч, 96 ч, 144 ч, проращиваемые проростки вынимали из термостата. Обычно это делали всегда в одно и то же время в 10.30 утра. Гнездовой способ посева позволял быстро из популяции посеянных семян отобрать непроросшие семена и переросшие проростки, а также выделить популяцию проростков, растущих более-менее равномерно. Популяция проростков, растущая более-менее равномерно, характеризовалась по росту и развитию колеоптиля (фиг. 4-9). Такая физиологическая характеристика сразу выделяла популяции проростков, отстающих по росту и развитию колеоптиля, а также растущие быстро проростки. Кроме того, такая характеристика позволяла выявить процент уродцев растений, которые имели размер колеоптиля ≈ 1 см, но с проклюнувшимся листом.

Мы проанализировали вышеизложенным способом десять сортов пшеницы (фиг. 1-3). Чтобы наглядно в рабочем порядке пользоваться данными физиологической оценки популяции семян и отбирать для биохимического анализа стандартизированные физиологически выравненные популяции проростков, мы решили сделать карты физиологической оценки семян, используемых для получения проростков с целью биохимического анализа.

На фиг. 1-3 представлена характеристика десяти сортов пшеницы по количеству семян в 1 г и массы одного семени. Эти данные свидетельствуют о потенциальной трофической способности семян. Также представлены годы сбора урожая и времени (по оси абсцисс) проращивания семян пшеницы в лабораторных условиях с указанием процента (по оси ординат) всхожести семян в течение суток. Эти данные свидетельствуют о силе всхожести популяции семян и дают информацию о том, если сила всхожести популяции семян низкая, то это отражается и на индивидуальном физиологическом развитии проросшей популяции семян.

Шифр 1 - соответствует сорту пшеницы Московская-35 /суперэлита, п. Чишмы, Башкирия/.

Шифр 1a - соответствует сорту пшеницы Московская-35 /репродукция - 1, п. Чишмы, Башкирия/.

Шифр 1b - соответствует сорту пшеницы Московская-35 /суперэлита, п. Чишмы-Удряк, Башкирия/.

Шифр 2 - соответствует сорту пшеницы Московская-35, инокулированной пыльной головней /суперэлита, п. Чишмы, Башкирия/.

Шифр 3 - соответствует сорту пшеницы Мироновская яровая /репродукция: P-3, п. Мироновка, Украина/.

Шифр 3a - соответствует сорту пшеницы Мироновская яровая /репродукция: P-2, п. Мироновка, Украина/.

Шифр 4 - соответствует сорту пшеницы Мироновская 808 /репродукция: P-3, Мироновская, Украина/.

Шифр 4a - соответствует сорту пшеницы Мироновская 808 /репродукция: P-1, п. Мироновка, Украина/.

Шифр 4b - соответствует сорту пшеницы Мироновская 808 /репродукция: P-2, п. Мироновка, Украина/.

Шифр 4c - соответствует сорту пшеницы Мироновская 808 /репродукция: P-1, п. Ровенки, Украина/.

На фиг. 4-6 представлена карта физиологической оценки популяции семян сорта Мироновская 808 /шифр 4c на фиг. 1-3/.

A: нормально развивающаяся популяция проростков по росту и развитию колеоптиля (прямые вертикальные линии, a - f) и отстающая по развитию колеоптиля популяция проростков /под угловыми линиями: a' - e').

Эти данные свидетельствуют о том, что:
a' - популяция проростков, находящаяся под угловыми линиями в интервале 48 ч _→ 144 ч, соответствует развитию популяции проростков /a - 24 ч/,
b' - популяции проростков, находящихся под угловыми линиями в интервале 72 ч _→ 144 ч, соответствует развитию популяции проростков по росту колеоптиля /b - 48 ч/,
c' - популяция проростков, находящаяся под угловыми линиями в интервале 96 ч _→ 144 ч, соответствует развитию популяции проростков по росту колеоптиля /c - 72 ч/,
d' - популяция проростков, находящаяся под угловыми линиями в интервале 120 ч - 144 ч, соответствует развитию популяции проростков по росту колеоптиля /d - 96 ч/,
e' - популяция проростков, находящаяся под угловыми линиями в интервале 144 ч, соответствует развитию популяции проростков по росту колеоптиля /e - 120 ч/.

B: нормально развивающиеся по росту колеоптиля проростки a - f. Этот рисунок свидетельствует о том, что остановка роста колеоптиля произошла в 120 ч и лист вышел из колеоптиля, 1 - колеоптиль, 2 - первый лист.

A, B: на оси абсцисс представлены интервалы времени отделения проростков от эндосперма семян.

A: на оси ординат указан процент нормально развивающейся /a - f/ и отстающей /a' - e'/ популяции проростков по росту и развитию колеоптиля.

B: на оси ординат указаны размеры осевых органов /24 ч/, колеоптиля /1/, первого листа /2/ в см.

C: на оси абсцисс представлены размеры колеоптиля нормально развивающейся популяции проростков /a - f/ в интервалы времени отделения их от эндосперма семени /24 ч _→ 144 ч/. На оси ординат представлено в процентном выражении количество нормально развивающихся проростков /a - f/ по длине /в см/ осевых органов /24 ч/ и колеоптиля. Этот рисунок показывает, что в эксперимент для биохимического анализа были взяты по размеру те ткани растений, популяция которых имела высший процент развития.

На фиг. 7-9 представлена карта физиологической оценки популяции семян сорта пшеницы Мироновская яровая /шифр 3 на фиг. 1-3/.

A: нормально развивающаяся популяция проростков по росту и развитию колеоптиля /прямые вертикальные линии: a-e/ и отстающая по развитию колеоптиля популяция проростков /под угловыми линиями: a' - d'/.

Эти данные свидетельствуют о том, что:
a' - популяция проростков, находящаяся под угловыми линиями в интервале 48 ч _→ 120 ч, соответствует развитию популяции проростков /a - 24 ч/;
b' - популяция проростков, находящаяся под угловыми линиями в интервале 72 ч _→ 120 ч, соответствует популяции проростков по росту и развитию колеоптиля /6 - 48 ч/;
c' - популяция проростков, находящаяся под угловыми линиями в интервале 96 ч _→ 120 ч, соответствует популяции проростков по росту и развитию колеоптиля /c - 72 ч/;
d' - популяция проростков, находящаяся под угловыми линиями в интервале 120 ч, соответствует популяции проростков по росту и развитию колеоптиля /d - 96 ч/. Отрезок /e - 96 ч/ указывает о наличии популяции проростков с проклюнувшимся через колеоптиль первым листом.

B: нормально развивающаяся по росту колеоптиля популяция проростков /a - e/. Этот рисунок свидетельствует о том, что остановка роста колеоптиля /1/ практически произошла в 96 ч и появилась популяция проростков /e - 96 ч/ с вышедшим из-под колеоптиля первым листом /2/.

A, B: на оси абсцисс представлены интервалы времени отделения проростков от эндосперма.

A: на оси абсцисс указан процент нормально развивающейся /a - e/ и отстающей /a' - d'/ популяций проростков по росту и развитию колеоптиля.

B: на оси ординат указаны размеры осевых органов /24 ч/, колеоптиля /1/, первого листа /2/ в см.

C: на оси абсцисс представлены размеры колеоптиля нормально развивающейся популяции проростков /a - e/ в интервалы времени отделения их от эндосперма /24 ч _→ 120 ч/, на оси ординат представлено в процентном выражении количество нормально развивающихся проростков /a - e/ по длине /в см/ осевых органов /24 ч/ и колеоптиля.

Этот рисунок также показывает, что в эксперимент для биохимического анализа были взяты по размеру те ткани растений, популяция которых имела наивысший количественный процент развития.

Карты физиологической оценки популяции семян, представленные на фиг. 4-9, показывают четкое различие в физиологических особенностях растущих колеоптилей, проростков, которые надо учитывать при отборе популяций проростков для биохимического анализа.

На фиг. 10 представлена карта физиологической оценки развития колеоптиля /A/ и органообразующей "метамерной ткани" по морфологическому оформлению и выделению их метамерной ткани /B/ в определенных интервалах времени /48 ч _→ 120 ч/ осевых органов: колеоптиля /0/, 1-го, 2-го, 3-го листьев /A/, а также корешков 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го /C, D/.

A: на оси абсцисс указаны интервалы времени отделения надземных осевых органов от эндосперма семян пшеницы.

На оси ординат указаны размеры осевых органов колеоптиля /0/, 1-го, 2-го, 3-го листьев в см.

B: представлена визуальная характеристика при микроскопическом увеличении в 210 раз морфологической организации "органообразующей метамерной ткани" через определенные интервалы времени отделения проростков от эндосперма семян пшеницы.

C: на оси абсцисс представлены размеры в см /a_1,2,3 - e_1,2,3/ нормально развивающейся популяции проростков по развитию колеоптиля /a - e/ через определенные интервалы времени отделения проростков от эндосперма семени пшеницы.

На оси ординат представлено в процентном выражении количество популяции проростков с определенными физиологическими показателями роста /в см/ колеоптиля /a_1,2,3 - e_1,2,3/ в определенные интервалы времени отделения проростков от эндосперма семени.

D: на оси абсцисс указано количество морфологически оформившихся корешков в популяции проростков /a_1,2,3 - e_1,2,3/, выделившихся из органообразующейся ткани /B/ популяции проростков, охарактеризованных физиологически по росту колеоптиля в определенные интервалы времени отделения проростков от эндосперма семени.

На оси ординат представлены в процентном выражении количество популяции проростков /a_1,2,3 - e_1,2,3/ по количеству выделившихся морфологически оформленных корешков.

Эта картина позволяет отобрать для биохимического анализа популяции проростков, физиологически стандартизованных не только по развитию колеоптиля, но и по развитию корневой системы.

Предложенный способ рекомендуется для наглядного, графического картирования стандартизации физиологической оценки растущих проростков растений с целью указания популяции проростков, отобранных для биохимического анализа физиологически выравненных клеточных органелл, их надмолекулярных структур в процессе развертывания морфо- и онтогенетических программ развития.

Источники информации
1. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ выделения клеточных ядер. Авторское свидетельство N 1701747. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 1 сентября 1991 г.

2. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью. Авторское свидетельство N 1733471. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 15 января 1992 г.

3. Дженн Р. К., Амен Р.Д. Что такое прорастание // В кн. "Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. М.: Колос, 1982, с. 19-46.

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений, может быть применено в молекулярной биологии развития, а именно в исследовании молекулярно-генетических механизмов формирования онтогенетических реакций при развертывании генетических программ развития, определяющих морфогенез и онтогенез при дифференциальном росте растений. Цель изобретения: в связи с отсутствием в литературных источниках стандартизации физиологической характеристики популяции семян и проростков, используемых в качестве биохимического объекта исследования, предлагается способ графического изображения в виде карт физиологической оценки популяции семян и растущих проростков с указанием физиологических особенностей популяции проростков, отобранных для биохимического анализа или для выделения физиологически однородных клеточных органелл и их надмолекулярных структур. Указанная цель достигается тем, что просеянная через сито популяция семян освобождается от обломков и поврежденных семян; оценивается количество семян в 1 г и эти данные, а также данные всхожести семян, популяционной неоднозначности роста и развития колеоптилей, корневой системы вносятся в карту физиологической оценки, анализ которой позволяет сделать выборку физиологически однородного объекта - растущих проростков для биохимического анализа и выделения физиологически выравненных клеточных органелл, например, клеточных ядер и их надмолекулярных структур. 10 ил.

Способ оценки физиологического состояния проростков, предусматривающий определение характеристики прорастания с указанием времени после начала набухания семян, отличающийся тем, что перед определением характеристики прорастания проводят отбор пробы более однородных по массе семян, подсчет их количества в 1 г для вычисления массы одного семени с последующим их проращиванием, а определение характеристики семян ведут через каждые 24 ч с использованием графических показателей роста и развития проростков.