СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПЛАЗМИД BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI Российский патент 2003 года по МПК C12N15/10 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается метода выделения плазмид возбудителя мелиоидоза, использующихся в качестве эпидемиологического маркера при внутривидовом типировании штаммов.

Для эндемичных стран и регионов характерна циркуляция штаммов возбудителя мелиоидоза, гетерогенных по тому или иному признаку. В то же время в завозных (вторичных) очагах инфекции выделяемые культуры B.pseudomallei, как правило, имеют идентичные фенотипические свойства, что позволяет в ряде случаев выявить первичный источник инфекции (Galimand P.M., Dodin A. Bull.Soc. Path. Ex. - 1983. - N30. - P. 632-636). В качестве эпидемиологических маркеров для возбудителя мелиоидоза пытались использовать фаги, агглютинабельность типоспецифическими сыворотками, способность усваивать отдельные углеводородные соединения. Однако, в силу вариабельности фенотипа, на сегодняшний день ни один из данных маркеров не обеспечивает необходимую эффективность при расшифровке вспышек заболевания.

В ряде инфекций с помощью плазмидного анализа возможно проведение дифференциации близкородственных штаммов, их внутривидового типирования, а также эпидемиологического наблюдения и мониторинга инфекции (Holmberg S.D., Washmuth I. K. , Hickman-Brenner P.M., Cohen M.L. J. Clin. Microbiol. - 1984. - Vol. 19. - P. 100-104). При этом плазмиды используют в качестве дополнительного критерия генотипической дифференциации штаммов (Wigley P., Burton N. F. J. Appl. Microbiol. - 1999. - Vol. 86. - N 3. - Р. 460-468). За основу могут быть взяты плазмиды как с известной функцией, так и различные криптические плазмиды, содержащиеся в том или ином штамме. Уникальность набора собственных плазмид является простым и объективным маркером плазмидсодержащих штаммов, которые способны вызвать эпидемический процесс.

Известные методы выделения плазмид у близкородственных микроорганизмов родов Pseudomonas и Burkholderia оказались неэффективными для плазмид большой молекулярной массы возбудителя мелиоидоза. В частности, метод Kado C.I., Liu S. T. (Kado C.I., Liu S.T. J.Bacteriol. - 1981. - Vol. 145. - P.1365) в целом недостаточно воспроизводим при работе с культурами B.pseudomallei, обладающих способностью к морфологической диссоциации, характерной для большинства штаммов возбудителя мелиоидоза.

Близкий аналог предлагаемого способа выделения плазмид из штаммов близкородственного вида В. cepacia описан в статье Lennon E. и DeCicco B.T. (Appi Environ Microbiol. - 1991. - Vol. 57. - N 8. - P. 2345-2350). В данной публикации описан модифицированный метод быстрой щелочной экстракции плазмидной ДНК. Однако, при проведении плазмидного анализа штаммов возбудителя мелиоидоза данным методом удалось выявить плазмиду размером 13 т.п.н. только в одном штамме B.pseudomallei ВКМ-900. Более крупные плазмиды обнаружить не удалось. Данный метод оказался непригодным для стабильного выявления плазмид в штаммах, отличающихся по морфологии колоний. Недостатками предлагаемого метода являлись плохой лизис клеток возбудителя мелиоидоза и недостаточная депротеинизация препаратов ДНК, что приводило к появлению "шмеров" при электрофорезе в агарозном геле и затруднению интерпретации результатов.

Целью настоящего изобретения является оптимизация и упрощение способа выделения плазмид возбудителя мелиоидоза, которые могут быть использованы в качестве стабильного эпидемиологического маркера при внутривидовом типировании штаммов B.pseudomallei.

Для достижения цели используют метод выделения плазмид, который нацелен на обеспечение качественного и в то же время "мягкого" лизиса клеток, гарантирующего сохранение плазмидной ДНК, в том числе при последующей депротеинизации и концентрации препарата.

Учитывая, что работа проводится с возбудителем особо опасного инфекционного заболевания, выращивание культур исследуемых штаммов производят на плотной питательной среде с сердечно-мозговым экстрактом, что позволяет исключить этап центрифугирования заразного материала и уменьшить время на проведение анализа. Для эффективного выделения плазмидной ДНК культуру возбудителя мелиоидоза выращивают 16-18 час.

Бактериальные клетки смывают со скошенного агара и ресуспендирют в низкосолевом буфере: 40 мМ Трис-ацетата, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0. При этом первичная отмывка бактериальной массы буфером, содержащим ЭДТА, упраздняется. Это связано с вероятностью лизиса клеток отдельных штаммов уже в процессе смыва, что уменьшает выход препарата плазмидной ДНК. В целях стандартизации механических воздействий для перемешивания лизата используют магнитную мешалку. Суспензию готовят плотностью 1 млрд м.к./мл и по каплям смешивают 3 мл суспензии с 6 мл лизирующего буфера: 5% додецилсульфата натрия, 50 мМ Трис, 50 мМ ЭДТА, рН 12,6. Перемешивают суспензию при температуре 18-24^oС в течение 3 мин при 100 об/мин и прогревают лизат в течение 15 мин при 60^oС. В этом случае прогревание, а также повышение концентрации SDS и ЭДТА улучшает лизис клеток. Нейтрализация раствора при температуре 18-24^oС является оптимальной для выделения плазмидной ДНК из штаммов возбудителя мелиоидоза. С этой целью, не прогревая лизат, добавляют 0,1 объема 2М раствора Tris-HCl, рН 8,0, перемешивают 3 мин при 100 об/мин и затем добавляют 0,1 объем 5М NaCl. После перемешивания лизата по каплям вносят равное количество забуференного свежеперегнанного фенола. Перемешивают 3 мин при 100 об/мин, оставляют при комнатной температуре на 10 мин и повторно перемешивают в том же режиме. Через 10 мин после отстоя суспензии отбирают водную фазу и проводят однократную обработку хлороформом. Выдерживают 5 мин на льду. Дополнительно добавляют 0,1 объем 5М NaCl к водной фазе, перемешивают и выдерживают 10 мин на льду. Увеличение концентрации NaCl на данном этапе позволяет провести лучшее очищение препарата плазмидной ДНК. После центрифугирования лизата при 15 тыс. об/мин в течение 10 мин отбирают 40 мкл надосадочной жидкости. Для электрофоретического исследования добавляют 5 мкл краски с буферным раствором: 3 mM Tris, pH 7,2; 0,25% бромфенолового синего; 90% глицерина. После перемешивания вносят в лунку для электрофореза. Увеличение процента глицерина в краске облегчает нанесение препарата в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят в 0,8% агарозном геле в течение 4 ч при 5 v/CM.

При проведении таким образом плазмидного анализа увеличивается выход плазмидной ДНК с различной молекулярной массой независимо от морфологии штаммов, повышаются чувствительность и воспроизводимость метода, что позволяет использовать выявленные плазмиды в качестве эпидемиологического маркера при внутривидовом типировании штаммов возбудителя мелиоидоза по плазмидному спектру.

Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Ускоренное выделение плазмидной ДНК
Исследуемые штаммы возбудителя мелиоидоза высевают на плотную питательную среду с сердечно-мозговым экстрактом и выращивают в пробирках со скошенным агаром при 37^oС в течение 16-18 час. Культивирование на плотной среде позволяет исключить этап центрифугирования заразного материала при выделении ДНК и уменьшить время на проведение анализа. Применение более поздних культур приводит к ослизнению колоний возбудителя мелиоидоза и ухудшению лизиса бактериальных клеток, что сказывается на выходе препарата плазмидной ДНК, качестве электрофореза и в конечном итоге стабильности выявления эпидемиологического маркера.

Бактериальные клетки смывают со скошенного агара низкосолевым буфером, содержащим 40 мМ Трис-ацетата, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0 и доводят концентрацию клеток до 1 млрд м.к./мл. 3 мл суспензии по каплям смешивают во флаконах объемом 50 мл с 6 мл лизирующего буфера: 5% додецилсульфата натрия, 50 мМ Трис, 50 мМ ЭДТА, рН 12,6. Перемешивают 3 мин при 100 об/мин на магнитной мешалке при температуре 18-24^oС и прогревают лизат в течение 15 мин при 60^oС. Использование магнитной мешалки позволяет стандартизовать механические воздействия при перемешивании лизата, а прогревание и повышенная концентрация SDS и ЭДТА облегчает лизис клеток возбудителя мелиоидоза, независимо от морфологии штаммов. После просветления лизата добавляют 900 мкл 2М раствора Tris-HCl, рН 8,0, перемешивают 3 мин при 100 об/мин и температуре 18-24^oС и затем добавляют 990 мкл 5М NaCl. После перемешивания лизата в течение 3 мин по каплям добавляют равное количество забуференного свежеперегнанного фенола. Перемешивают 3 мин при 100 об/мин, оставляют при комнатной температуре на 10 мин и повторно перемешивают в том же режиме. Через 10 мин после отстоя суспензии отбирают 8 мл водной фазы в новые флаконы на 20 мл и смешивают с равным объемом хлороформа. После перемешивания выдерживают 5 мин на льду. Дополнительно добавляют 160 мкл 5М NaCl к водной фазе, перемешивают и выдерживают 10 мин на льду для лучшего очищения препарата плазмидной ДНК. Отбирают 1 мл суспензии в 1,5 мл пробирки и после центрифугирования на микрофуге в течение 10 мин при 15 тыс. об/мин отбирают в новую пробирку 100 мкл надосадочной жидкости. Для электрофоретического исследования к 40 мкл добавляют 5 мкл краски, содержащей 3 mM Tris, 0,25% бромфенолового синего, 90% глицерина, рН 7,2 и вносят в лунку для электрофореза. Увеличение процента глицерина в краске облегчает нанесение препарата в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят в 0,7-0,8% агарозном геле в течение 4 ч при 5 v/см в трис-боратном буфере с последующей окраской ДНК этидиум бромидом с концентрацией 0,5 мкг/мл в течение 20 мин, отмывкой в течение 10 мин в H₂O и визуализацией в УФ-свете. Результаты оценивают по наличию в геле после электрофореза полосы плазмидной ДНК и ее положению по отношению к контрольным маркерным ДНК известных размеров. В качестве примера на чертеже показана электрофореграмма ДНК плазмид, выделенных из различных штаммов возбудителя мелиоидоза.

Пример 2. Внутривидовое типирование штамов по плазмидному спектру
При проведении предлагаемым способом плазмидного скрининга 30 штаммов возбудителя мелиоидоза плазмидные ДНК различного размера обнаружены в 13 штаммах. В 17 штаммах возбудителя мелиоидоза плазмидная ДНК отсутствует.

Характеристика плазмид, обнаруженных в различных штаммах возбудителя мелиоидоза, следующая:
Наличие плазмид, т.п.н. - Количество штаммов
13 - 3
43,5 - 5
160 - 4
168 т.п.н. - 1
Отсутствуют - 17
По наличию или отсутствию плазмидной ДНК формируют группы штаммов возбудителя мелиоидоза и таким образом проводят внутривидовое типирование по плазмидному маркеру. В I группу относят штаммы, содержащие плазмиду 13 т.п. н., II группу составляют штаммы с плазмидой 43,5 т.п.н., в III группу входят штаммы, содержащие плазмидную ДНК размером 160 т.п.н., в IV группу объединены штаммы с плазмидой размером 168 т.п.н. и V группа штаммов - бесплазмидные.

Плазмиды сохраняются в плазмидсодержащих штаммах при длительном выращивании культур на различных питательных средах, а также при пассажах на лабораторных животных, что подтверждает стабильное наследование плазмидных репликонов и возможность их использования в качестве эпидемиологического маркера.

Благодаря предложенному способу выделения, стало возможно выявление плазмид с различной молекулярной массой (от 13 до 168 т.п.н.), что позволило имеющиеся в коллекции штаммы возбудителя мелиоидоза разбить на 5 групп, отличающихся по наличию плазмидных репликонов. Кроме того, учитывая стабильное наследование плазмидных репликонов, рекомендовать выявленные плазмиды к использованию в качестве эпидемиологического маркера и дополнительного критерия внутривидового типирования штаммов возбудителя мелиоидоза. Это может облегчить поиск источника инфекции, в частности, при возникновении инфекционного процесса, вызванного плазмидсодержащим штаммом B.pseudomallei.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается метода выделения плазмид возбудителя мелиоидоза. Способ предусматривает культивирование бактериальных клеток Burkholderia pseudomallei на плотной питательной среде с сердечно-мозговым экстрактом. Далее проводят смыв культивируемых клеток с их последующим лизисом. Полученный лизат центрифугируют и из надосадочной жидкости проводят выделение плазмид. Предложенный способ позволяет выделять плазмиды с молекулярной массой от 13 до 168 т.п.н. Плазмиды, выделенные с помощью предложенного способа, могут быть использованы в качестве эпидемиологического маркера при дифференциации и группировке штаммов возбудителя мелиоидоза по плазмидному спектру. 1 ил.

Способ выделения плазмид Burkholderia pseudomallei, включающий культивирование бактериальных клеток Burkholderia pseudomallei и выделение плазмид, отличающийся тем, что бактериальные клетки Burkholderia pseudomallei выращивают на плотной питательной среде с сердечно-мозговым экстрактом в течение 16-18 ч при 37°С, смывают низкосолевым буфером, содержащим 40 мМ Трис-ацетата, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0 и доводят суспензию до концентрации 1 млрд м.к./мл, по каплям смешивают 3 мл с 6 мл лизирующего буфера, содержащего 5% додецилсульфат натрия, 50 мМ Трис, 50 мМ ЭДТА, рН 12,6 и перемешивают на магнитной мешалке 3 мин при 100 об/мин и температуре 18-24°С, прогревают лизат в течение 15 мин при 60°С, после просветления лизата нейтрализуют раствор при температуре 18-24°С добавлением 900 мкл 2 М раствора Tris-HCl с рН 8,0 и перемешивают 3 мин при 100 об/мин и затем добавляют 990 мкл 5 М NaCl, после перемешивания лизата по каплям вносят равное количество забуференого свежеперегнанного фенола, перемешивают 3 мин при 100 об/мин и оставляют при комнатной температуре на 10 мин, после чего повторно перемешивают в том же режиме, через 10 мин после отстоя суспензии отбирают водную фазу в новые флаконы на 20 мл и проводят однократную обработку хлороформом, выдерживают 5 мин на льду и дополнительно добавляют 160 мкл 5 М NaCl к водной фазе, после чего перемешивают и вновь выдерживают 10 мин на льду, отбирают 1 мл суспензии в 1,5 мл пробирки и после центрифугирования на микрофуге в течение 10 мин при 15 тыс. об/мин отбирают в новую пробирку 40 мкл надосадочной жидкости, добавляют 5 мкл краски, содержащей 3 мM Tris, 0,25% бромфенолового синего, 90% глицерина, рН 7,2 и вносят в лунку для электрофореза, проводят электрофорез в 0,8% агарозном геле в течение 4 ч при 5 В/см в трис-боратном буфере с последующей окраской ДНК этидиум бромидом с концентрацией 0,5 мкг/мл в течение 20 мин, отмывкой в течение 10 мин в Н₂О и визуализацией в УФ-свете.