СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОФИЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ (HEMOPHILUS INFLUENZAE) Российский патент 2002 года по МПК G01N33/569 G01N33/536 

Данное изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно выявления Hemophilus influenzae.

В последние два десятилетия отмечались высокие подъемы гемофильных менингитов.

По данным ВОЗ уровень заболеваемости гемофильным менингитом в развитых странах снижается, а в странах бывшего СССР Азии, Африки и Латинской Америки отмечается резкий подъем.

Прогноз при гемофильных менингитах неблагоприятный. Так по данным разных авторов летальность составляет от 3% до 33%, частота резидуальных последствий достигает 16-40%. По данным Robbins (1976) основной причиной умственной отсталости в США, в 70-е годы, являлись менингиты этой этиологии. Своевременная постановка диагноза гемофильной инфекции возможна только путем выделения возбудителя и его идентификации или выявлением в организме больного специфических антител и антигена возбудителя, выявление которых с высокой степенью достоверности позволяет проводить углубленное изучение патогенеза заболевания и использовать полученные данные для назначения индивидуальной патогенетической терапии.

Известным способом выявления гемофильной палочки является бактериологическая диагностика (Приказ М3 РФ 375 от 23.12.98г. "О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов").

1-й день исследования.

1. Спиномозговую жидкость (1,0 мл) забирают стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки и по 2-3 капли засевают на поверхность 2-х чашек Петри с подогретой питательной средой (1 чашка "шоколадный" агар, 2 чашка сывороточный).

2. Инкубируют при температуре 37^oС при повышенном содержании СO₂, 24часа.

3. Приготовление мазков.

4. Окраска мазков по Граму.

5. Микроскопия мазков.

2-й день исследования.

1. Просмотр чашек визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа, лупы МБС.

2. Приготовление мазков-препаратов.

3. Окраска мазков по Граму.

4. Микроскопия мазков.

3-й день исследования.

Идентификация гемофилов:
1. серотипирование
2. определение биовара
Этот метод позволяет получить хорошие результаты. Однако существуют обстоятельства, снижающие его эффективность: он занимает много времени (3-4 суток), трудоемок и для получения результатов требуются дорогостоящие питательные среды и реагенты.

Наиболее близким к предлагаемому нами способу является метод иммуноферментного анализа (ELISA) для антигена Hemophilus influenzae "b" в ликворе, предложенный Roggen, E.L, R. Pansaerts, E. Van Dyck, and Piot. 1993 (Journal Clin. Microbiol. 31.1820-1825).

1. Отцентрифугированную и отфильтрованную спиномозговую жидкость фиксируют на 1% бычьем сывороточном альбумине в специальных планшетах при комнатной температуре.

2. Обрабатывают 2% бараньей сывороткой на карбонатном буфере с рН 9 при комнатной температуре.

3. Промывают в карбонатном буфере с рН 7,5.

4. Наносят кроличью сыворотку против антигена Hemophilus influenzae "b".

5. Наносят и инкубируют при комнатной температуре с коньюгатом антикроличьих IgG.

6. Обрабатывают О-фенилендиамином с перекисью водорода в цитратном буфере с рН 5.

Учет результатов реакции проводится в стандартном спектрофотометре при длине волны 490-600 нм.

Этот метод позволил авторам получить хорошие результаты. Однако недостатком данного метода является то, что он трудоемок и для получения результатов требуется специальное оборудование (микропланшеты и спектрофотометр), препараты невозможно длительно хранить и фотографировать. Данный метод не позволяет определить экспрессию Hemophilus influenzae "b" в структурных единицах тканей органов, без чего невозможно судить о степени их повреждения.

Технический результат изобретения заключается в упрощении способа диагностики гемофильной инфекции путем выявления антигена гемофильной палочки (Hemophilus influenzae "b"), отличающийся тем, что капсульный антиген гемофильной палочки (рибозилрибитолфосфат) определяют непрямым иммунопероксидазным методом, гистологические парафиновые срезы тканей органов выдерживают в 3-х порциях ксилола, по 15 мин в каждой, при температуре 60^oС, перед нанесением первой сыворотки, обрабатывают 0,3% Тритоном Х-100, в качестве антивидового коньюгата используют DAKO En Vision+System, HRP, и наличие положительного окрашивания в виде коричневых гранул при микроскопическом исследовании свидетельствует о выявлении гемофильной инфекции для возможного его применения в практическом здравоохранении, оценки тяжести течения инфекционного заболевания и своевременного назначения патогенетической терапии.

Для реализации этой цели авторами впервые предложен модифицированный непрямой иммунопероксидазный метод путем использования гистологических срезов кусочков тканей органов. Данный метод относится к иммуногистохимическим и основан на специфической реакции антиген-антитело. В отличие от иммуноферментного (ELISA) он отличается простотой постановки реакции, не уступая по специфичности и чувствительности, позволяет иметь постоянные препараты, поскольку интенсивность окраски не падает. Препараты можно просматривать в обычном световом микроскопе и фотографировать.

Стандартная схема непрямого иммунопероксидазного метода описана Дж. Полак, С.Ван-Норден. Введение в иммуноцитохимию, М., "Мецицина",1986г.

1 - промывка срезов в буфере,
2 - обработка 0,03% раствором перекиси водорода,
3 - промывка в буфере,
4 - нанесение на срез первых специфических антител,
5 - промывка в буфере,
6 - нанесение вторых антител, связанных с пероксидазой,
7 - промывка в буфере,
8 - обработка 0,03% раствором диаминобензидина (ДАБ),
9 - докраска гематоксилином,
10 - заключение в бальзам. Микроскопия.

Но как показывают данные литературы и собственный опыт, приведенная схема лишь в общем виде отражает ход постановки методики. В зависимости от размеров, структуры и природы выявляемого антигена необходима детальная разработка всех этапов, начиная с фиксации и до нанесения диаминобензидина.

Предложенный авторами метод отличается тем, что гистологические парафиновые срезы тканей в процессе депарафинизации выдерживают в 3-х порциях ксилола, по 15 мин в каждой, при температуре 60^oС, перед нанесением первой сыворотки обрабатывают 0,3% Тритоном Х-100, в качестве самого антивидового коньюгата используют DAKO En Vision+System, HRP, производства DAKO A/S Дания.

В рамках предлагаемого способа впервые предложена депарафинизация гистологических срезов в трех порциях ксилола при температуре 60^oС, что способствует повышению проницаемости клеточных мембран, устранению "сшивок" между белками. После такого воздействия антиген становится более доступным для антител, что является необходимым условием для их взаимодействия. Изменение условий депарафинизации от установленных величин не рекомендуется, поскольку в этом случае антиген остается недоступным для антител и нарушается полнота его выявления.

Одна из сложных проблем - это наличие в сыворотке загрязненных антител. Очистка же сыворотки приводит к снижению ее авидности. Значительное разведение специфической сыворотки также нежелательно, так как удлиняет время проведения реакции, может снизиться концентрация выявляемого антигена. Для устранения этих недостатков нами предложена обработка мазков 0,3% Тритон Х-100 в течение 15 мин при температуре 37^oС, которая предшествует нанесению первой сыворотки. Используемый детергент адсорбирует загрязненные антитела, в значительной мере устраняя неспецифическое окрашивание. Кроме вышеуказанного, ТритонХ-100 повышает проницаемость клеточных мембран, способствуя проникновению используемых антител в клетку.

Использование в качестве антивидовых антител DAKO En Vision+System, HRP, снизило количество неспецифического окрашивания, так как меченый полимер не содержит авидин или биотин, следовательно, неспецифическое окрашивание при взаимодействии авидина с эндогенным биотином в органах исключается.

Предложенный впервые новый способ выявления Hemophilus influenzae "b" и комплекс методических приемов, выполняемых в процессе иммунопероксидазного выявления капсульного антигена Hemophilus influenzae "b" (рибозилрибитолфосфат) является необходимым. Невыполнение последних не дает объективных результатов или искажает конечный результат исследований, не позволяет провести соответствующую интерпретацию полученных данных.

Предложенный способ осуществляется следующим образом:
1. Гистологические парафиновые срезы тканей депарафинизируют в трех порциях ксилола по 15 мин в каждой при температуре 60^oС.

2. Промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7.2-7.4) в течение 3-4 мин.

3. Обрабатывают 0,1% раствором Трипсина в 0,1% CaCl₂ в течение 20 мин.

4. Обрабатывают 0,03% перекисью водорода в течение 20 мин.

5. Промывают в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7.2) по 6 мин в каждой.

6. Инкубируют в 0,3% Тритон Х-100 при температуре 37^oС в течение 15 мин.

7. Наносят поликлональные кроличьи антитела к рибозилрибитолфосфату (любезно предоставленные проф. Костюковой Н.Н., институт Гамалея). Инкубируют с поликлональными антителами при температуре 37^oС в течение 45 мин.

8. Промывают в воде в течение 5 мин.

9. Промывают в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7.2) по 5 мин в каждой.

10. Наносят антивидовой коньюгат DAKO Еn Vision+System, HRP, и инкубируют в течение 45 мин в темной камере при комнатной температуре.

11. Промывают в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7.2) по 5 мин в каждой.

12. Обрабатывают материал в водном растворе, содержащим 0,05% 3,3-диаминобензидин тетрахлорида (ДАВ) и 0,025% перекиси водорода в течение 3 мин.

13. Слабо докрашивают гематоксилином.

14. Микроскопия.

Микроскопию окрашенных препаратов проводят в обычном микроскопе. Продукт реакции при исследовании тканевых структур, содержащих Hemophilus influenzae "b", выявляется в виде коричневых гранул внутриклеточно и на клеточной оболочке. При оценке данных микроскопического исследования важно учитывать возникновение артифициальных изменений, имитирующих положительную окраску. Чаще всего - это клеточные артефакты, выявляемые по краю препарата. В этом случае необходима оценка реакции на соседних участках.

Необходимые контроли.

Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.

1) Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве первого слоя наносят неиммунную сыворотку или буфер (результаты должны быть отрицательными).

2) Неспецифичность сыворотки устраняют посредством максимального разведения высококонцентрированной сыворотки и укорочения времени инкубации.

Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения:
Было проведено исследование аутопсийного материала 15 умерших в острый период гемофильной (вызванной Hemophilus influenzae - b) инфекции, у 12 из них была выявлена экспрессия капсульного антигена Hemophilus influenzae "b". В трех случаях, когда экспрессия рибозилрибитолфосфата не определялась, при дальнейшем бактериологическом исследовании аутопсийного материала была установлена пневмококковая этиология заболевания.

В качестве примера приводим микрофотографии ткани и оболочек головного мозга с четко определяемой экспрессией капсульного антигена Hemophilus influenzae "b" больной Бурковой Марии, 2 года 10 мес, N истории болезни 3316 от 13.05.99г. , с гемофильной инфекцией в острой фазе тяжелого течения заболевания (см. фиг. 1 и 2).

Таким образом, предложенный способ позволяет с высокой степенью специфичности и достоверности выявить экспрессию капсульного антигена Hemophilus influenzae "b"(рибозилрибитолфосфат) в тканях органов.

Метод достаточно прост, возможно его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого определения Hemophilus influenzae "b" в тканях органов и, соответственно, оценки тяжести течения заболевания и своевременного назначения патогенетической терапии.

Предлагаемый способ имеет экономическую значимость, т.к. при этом не требуется применения дополнительного лабораторного оборудования.

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, а именно выявления экспрессии капсульного антигена Hemophilus influenzae "b" в тканях органов. Способ обеспечивает упрощение диагностики Hemophilus influenzae "b" путем выявления рибозилрибитолфосфата - антигена Hemophilus influenzae "b" с помощью модифицированного непрямого иммунопероксидазного метода в тканевых структурах органов для возможного его применения в практическом здравоохранении, оценки тяжести течения заболевания и своевременного назначения патогенетической терапии. Проводят непрямой иммунопероксидазный метод, при этом гистологические парафиновые срезы биопсийного и аутопсийного материала выдерживают в 3-х порциях ксилола по 15 мин в каждой при температуре 60^oС, обрабатывают 0,3% Тритоном Х-100, наносят поликлональные кроличьи антитела к рибозилрибитолфосфату, промывают и наносят антивидовой конъюгат HRP, инкубируют и окрашивают, после чего проводят микроскопическое исследование и при наличии коричневых гранул внутриклеточно и на клеточной оболочке диагностируют гемофильную инфекцию. 2 ил.

Способ диагностики гемофильной инфекции путем выявления антигена гемофильной палочки Hemophilus influenzae "b", отличающийся тем, что определяют непрямым иммунопероксидазным методом капсульный антиген Hemophilus influenzae "b" рибозилрибитолфосфат, при этом гистологические парафиновые срезы тканей органов выдерживают в 3-х порциях ксилола по 15 мин в каждой, при температуре 60^oС, обрабатывают 0,3% Тритоном Х-100, наносят поликлональные кроличьи антитела к рибозилрибитолфосфату, промывают и наносят антивидовой конъюгат HRP, инкубируют и окрашивают, после чего проводят микроскопическое исследование и при наличии коричневых гранул внутриклеточно и на клеточной оболочке диагностируют гемофильную инфекцию.