Способ выявления антигена вируса простого герпеса Советский патент 1993 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к постмортальной диагностике герпетической инфекции.

Цель изобретения - ускорение постановки этиологического диагноза,

Для реализации этой цели исходили из того; что в работе прозектур, в качестве форсирующего раствора используется Ю-30%- ный раствор формалина, приготовленный путем разведения формальдегида обычной водой. Как показали наши исследования, для проведения иммунопероксидазной реакции возможно использование только за- буференного 10%-ного формалина. При этом необходимо строго придерживаться определенного времени фиксации. Так, меньшая продолжительность фиксации приводит к диффузии, вымыванию антигена, а длительная - обуславливает маскировку антигена, образование большого числа альдегидных связей, препятствующих реакции антигенантитело. Для получения морфологической картины и возможности выявления антигена ВПГ в ткани, исследуемый орган должен фиксироваться в 10%-ном нейтральном формалине 30 ч, с последующей дофиксацией кусочков в этом же фиксаторе в течение 12-15 ч. Более длительная фиксация подавляет взаимодействие антиген-антитело, приводит к снижению концентрации выявляемого антигена.

Нами впервые также предложено депа- рафинирование срезов в 3 порциях ксилола при 56-60°С в течение 10 мин. Это обеспечивает полное удаление не только парафина, но и пластических веществ, образуемых в результате заливки в горячий парафин. Общепринятое удаление парафина в ксилоле при комнатной температуре не обеспечивает очистки срезов от примесей, которые могут быть местом неспецифической реакции и значительно затрудняют интерпретацию полученных результатов.

СО

с

00

ю

OJ

OJ

Впервые предложена обработка срезов 15-20%-ным раствором сахарозы, что способствует повышению проницаемости тканевых мембран, устранению сшивок между белками, образуемых в результате фиксации и заливки. Сахароза является индиферентным веществом, в отличие от фермента трипсина, используемого в этих же целях. После воздействия сахарозы, антиген становится более доступным для антител, что является необходимым условием для их взаимодействия. Уменьшение или повышение концентрации сахарозы от установленных величин не рекомендуется, поскольку в первом случае антиген остается недоступным для антител, а во втором - нарушается полнота выявления антигена,

Одна из сложных проблем, это наличие в сыворотке загрязненных антител. Очистка же сыворотки приводит к снижению ее авидности. Значительное разведение специфической сыворотки, также нежелательно, т.к. удлиняет время проведения реакции, мржет снизится концентрация выявляемого антигена. Для устранения этих недостатков нами предложена обработка срезов 1% бычьим сывороточным альбумином на фосфатно-солевом буфере в течение 30 мин, которое предшествует нанесению первой и второй сывороток. Используемый альбумин адсорбирует загрязняющие антитела, в значительной мере устраняется неспецифическое окрашивание.

Предложенный впервые комплекс методических приемов, выполняемых в процессе иммунопероксидазного выявления антигена вируса герпеса является обязательным. Невыполнение их не дает объективных результатов или искажает конечный результат исследований, не позволяет провести соответствующую интерпретацию для постановки диагноза.

Описание способа: фиксация секционного материала в 10% нейтральном формалине в течение 1,5 сут с последующей дофиксацией кусочка из исследуемого органа в этом же растворе в течение 12-15 ч; заливка в парафин; депарафини ово ие в 3 порциях ксилола при 5б-бО°С в течение 10 мин; обработка срезов в 15-20%-ном растворе сахарозы на фосфатно-солевом буфере рН 7,2 (на ночь); промывка в фосфатно-солевом буфере, рН 7,2 в течение 30 мин; обработка перекисью водорода (Н202) 0,3% на воде в течение 30 мин; промывка в 1 %-ном растворе бычьего сывороточного альбумина 30 мин; нанесение на срез антигерпетической сыворотки 45 мин при 37°С. Разведение сыворотки зависит от исходного титра антител; промывка в фосфатно-солевом буфере с 1 %-ным бычьим сывороточным альбумином 30 мин; нанесение вторых антител, конъюгированных с пероксидазой в разведении 1:50 в течение 45 мин при

комнатной температуре; отмыть препараты в буфере в трех порциях по 5 мин; обработка срезов в водном растворе, содержащем 0,05% 3,3-диаминобензидинтетрахлориде и 0,025% Н202 в течение 5-10 мин; докраска

гематоксилином; заключение в бальзам.

Было проведено исследование головного мозга 26 умерших детей, у семерых из них (25%) был выявлен антиген вируса герпеса, что позволило, с учетом данных клиники и

5 характерных морфологических изменений поставить диагноз: герпетический менинго- энцефалит. Эти данные в 5 случаях были подтверждены результатами серологического исследования.

0 Пример. Умерший ребенок Д., 4 мес. Клинический диагноз: гнойный менингоэн- цефалит гемофильной этиологии. На вскрытии: мягкие мозговые оболочки резко отечны, базальная поверхность головного

5 мозга и височные полюса покрыты студенистой массой.

При микроскопическом исследовании окрашенных срезов головного мозга выявлены распространенные очаги некроза, уме0 ренная лимфоцитарная инфильтрация, большое количество клеток с резко гипер- хромным ядром, В головном мозге, как и в легких и печени антиген вируса простого герпеса. Антиген вируса в клетках исследу5 емых органов был представлен гранулами коричневого цвета или их конгломератами с различной интенсивностью окраски. Результаты гистологического и иммуноокси- дазного исследования позволили сформули0 ровать следующий диагноз: генерализован- ная герметическая инфекция. При этом результаты серологического исследования крови и ликвора на наличие противогерпе- тических антител были отрицательными,

5 Лишь при выделении на культуре ткани, из мозга был выделен вирус, типирующийся как герпес, тип-1, Эти данные свидетельствуют о высокой достоверности используемого способа для выявления антигена

0 вируса простого герпеса, позволивший быстро установить этиологию заболевания.

Головной мозг и другие внутренние органы погружали в 10%-ный нейтральный формалин на 30 ч, после чего вырезанные

5 кусочки органов дофиксировались в 10%- ном нейтральном формалине в течение 12 ч; заливали в парафин; срезы освобождали от парафина в 3 порциях ксилола при 56-60°С в течение 10 мин; отмывали в дистиллированной воде 3 раза; обрабатывали срезы в

15%-ном растворе сахарозы на фосфатно- солевом буфере (ночь); после промывки в буфере обрабатывали 0,3% Н202 на дистиллированной воде (30 мин); наносили кроличью специфическую антигерпетическую сыворотку в разведении 1:10 и инкубировали при 37°С в течение 45 мин; после обработки на дистиллированной воде промывали в 1 %-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) на фасфат- но-солевом растворе буфера (30 мин); многократно промывали в буфере, потом в буфере, содержащем 1 % БСА; наносили антикроличью сыворотку, коньюгированную с пероксидазой в разведении 1:50, инкубиро- вали в течение 45 мин при комнатной температуре; многократно смывали в буфере и погружали в водный раствор, содержащий 0,05% 3,3-диаминобензидинтетрахлорида 0,025% Н202; срезы тщательно промывали в буфере, докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.

Проведено исследование архивного материала хранившегося в парафиновых блоках более 5 лет. Иммунопероксидазное исследование мозга 4 детей, погибших от герпетического менингоэнцефалита, выявило во всех случаях массивное скопление антигена вируса герпеса в различных отделах мозга. Таким образом, предложенный спо- соб позволил ретроспективно изучить секционный материал и подтвердить в данном случае паталогоанатомический диагноз. Значимость проведения подобных исследований велика, поскольку при возникшей не-

обходимости возможно повторное исследо вание архивного материала

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей достоверностью выявить антиген вируса герпеса, установить его локализацию и характер распределения, что корригируете результатами серологического и вирусологического исследований.

Метод достаточно прост, возможно его широкое применение в патанатомической практике для постмортальной диагностики герпетической инфекции.

Предлагаемый способ имеет экономическую значимость, т.к. при этом не требуется отправка секционного материала в вирусологическую лабораторию для выделения вируса герпеса, что достаточно трудоемко и занимает большой промежуток времени.

Формула изобретения Способ выявления антигена вируса простого герпеса путем фиксации исследуемого материала, приготовления срезов и проведения иммунопероксидазной реакции, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, исследуемый материал фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине в течение 36-48 ч, трижды депарафи- нируют срезы в ксилоле при 5б-60°С в течение 10 мин, затем обрабатывают срезы в 15-20%-ном растворе сахарозы на фос- фатно-солевом буфере и промывают в фос- фатно-солевом буфере, содержащем 1 % бычьего сывороточного альбумина.

Использование: изобретение относится к постмортальной диагностике герпетической инфекции. Цель изобретения - ускорение постановки этиологического диагноза. Сущность изобретения: для достижения поставленной цели материал фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине, удаляют парафин ксилолом при 56-60°С, обрабатывают 15-20%-ным раствором сахарозы на буфере, используя для промывки на отдельных этапах выявления 1 %-ный бычий сывороточный альбумин на фосфатно-солевом буфере. Положительный эффект: способ позволяет достоверно выявлять антиген вируса простого герпеса.