СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАДИИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА В ТЕСТАХ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/68 G01N33/566 

Изобретение относится к медицине, конкретно к лабораторной диагностике иммунологическими методами. Способ может быть использован при иммунологической диагностике различных патологических состояний.

Определение признаков, позволяющих диагностировать стадию активности патологического процесса, дает возможность сформировать эффективный терапевтический комплекс, ускоряющий процесс выздоровления или выхода в ремиссию, а также подойти к прогнозированию развития болезни.

Активность патологических процессов в настоящее время определяется с помощью проведения оценки различных биохимических параметров, в части случаев, характерных для отдельных видов патологии (патент N 2039984, БИ N 20,1995; патент N 2042950, БИ N 24, 1995; патент N 1527589, БИ N 45,1989). Так, В.Г. Куницын с соавт. (патент N 2034293, БИ N 12, 1995) диагностировали стадию обострения и ремиссии рассеянного склероза по активности Na⁺ К⁺ - AT фазы эритроцитов в интервале МАТФ с вычислением константы Михаэлиса.

Между тем, оценка состояния иммунной системы может дать более точную и универсальную информацию о стадиях активности патологических процессов, поскольку иммунная система отражает все изменения в организме, активно участвуя в этих процессах (патент N 1478123, БИ N 17, 1989; патент N 2021615, БИ N 19, 1994; патент N 2021609, БИ N 19, 1994; патент N 1743026, БИ N 27, 1995; патент N 1603303, БИ N 40, 1990; патент N 1364989, БИ N 1, 1988; патент N 1704084, БИ N 1, 1992; патент N 1720011, БИ N 10, 1992). Мезенцева М.В. с соавт. (Тез. докл III Национ. Конф. "Человек и лекарство". - М., 1996. С.36) выявила корреляцию с активностью процесса снижения одного из показателей иммунных реакций - интерферона в сыворотке крови. Алихановым с соавт. (Тез. докл. Ill Республ. Национ. Конф. "Человек и лекарство". - М., 1996. -С. 64) была установлена фазная динамика большинства иммунологических показателей, которая зависела от выбора иммуномодулирующих препаратов, что позволило автору сделать вывод о необходимости дифференцированной контролируемой иммунокоррекции. Дзяк Г.В. с соавт. (патент N 1534400, БИ N 1, 1990) определяли активность ревматического процесса по увеличению в сравнении со здоровыми людьми числа специфических E-розеткообразующих клеток с эритроцитами барана, нагруженными антигенами миокарда или эндокарда, диагностируя эндокардит или миокардит соответственно.

Существующие методы диагностики стадий заболеваний имеют общие недостатки:
1) выявляют, в основном, лишь две противоположные фазы - активность процесса или ее отсутствие, благоприятное течение или неблагоприятное; 2) каждый способ диагностики определяет стадии активности только при конкретных нозологических формах; 3) относительная трудоемкость и разнообразие способов диагностики активности патологических процессов.

Попытка выявления различных стадий воспалительного процесса - фазы обострения, фазы стихающего обострения и ремиссии путем определения уровня сывороточных иммуноглобулинов классов А и М относительно уровня, зафиксированного при диспансерном наблюдении, была предпринята Ефимовой Е.Г. и Бобковым В. А. (патент N 2007323, БИ N 3, 1994), но ограниченность диагностического параметра, необходимость наличия у конкретного больного результатов предыдущих обследований для сравнения определяемого в момент диагностики результата сокращают ценность получаемой информации.

Ряд авторов (патент N 2008685, БИ N 4, 1994; патент N 1575711, БИ N 2, 1995; патент N 1409942, БИ N 26, 1988; патент N 2014607, БИ N 11, 1994; патент N 2038048, БИ N 18, 1995; патент N 205003, БИ N 34, 1995; патент N 2014605, БИ N 11, 1994) при оценке функциональной активности иммунной системы и эффекта препаратов иммуномодулирующего действия использовали различные индексы, отражающие динамику тех или иных параметров, определяемых до и после воздействия препарата либо на кровь, либо на организм пациента в ходе лечения. Сравнивались параметры, определяемые трудоемкими методами, требующими специального оборудования, реактивов и квалифицированных кадров, что является существенным недостатком приведенных исследований. Использовались индексы, загруженные цифрами, что усложняло получение информационного результата. Кроме того, в части случаев результат отражал ограниченную нозологически клиническую ситуацию.

Известен способ применения метода E-розеткообразования с препаратами, в том числе иммуномодулирующего действия, с целью выбора препарата для лечения - к левамизолу (патент N 1455318, БИ N 4, 1989), к тималину (патент N 1629849, БИ N 7, 1991), к кемантану (патент N 1629849, БИ N 7, 1991) с различными препаратами, определяя наличие у них иммуномодулирующей активности при сравнении с эффектом левамизола в реакции E-розеткообразования (патент N 1704084, БИ N 1, 1992) к грязевым экстрактам (БИ, 1997, N 5, патент N 2073870).

Недостатком указанных способов определения индивидуальной чувствительности является ограниченность диагностики каким-либо конкретным медицинским препаратом в каждом случае, а также тот факт, что диагностика проводится в рамках лишь определенной нозологической формы.

Ряд авторов определяли индивидуальную чувствительность к различным препаратам, используя другие иммунологические методы: в культуре лимфоцитов с Ла-подобными моноформными антигенами чувствительность лимфоцитов определяли по степени наибольшего снижения уровня ИКО-1 положительных клеток (патент N 1599776, БИ N 38, 1990), по изменению антителозависимой цитотоксичности нейтрофилов периферической крови (патент N 1658094, БИ N 23, 1991), по синтетической активности клеток крови (патент N 1720012, БИ N 10, 1992), по изменению показателя стабильности лизосомальных мембран (патент N 1727077, БИ N 14, 1992), по влиянию препаратов на экспрессию дифференцировочных антигенов СД 3, 4, 8, 38, HLA 1 (патент N 2052192, БИ N 1, 1996).

Существенным недостатком всех указанных способов определения индивидуальной чувствительности к препаратам иммуномодулирующего действия являются значительная затратность и трудоемкость их, кроме того, проведение исследований указанными способами предусматривает наличие специального дорогостоящего оборудования и квалифицированных кадров, что исключает возможность использования этих методов диагностики широко в практике лечебных учреждений.

Некоторыми исследователями обнаруживались значительные различия в чувствительности к иммуномодулирующим препаратам у лабораторных животных, для определения которой использовались тест гиперчувствительности замедленного типа (Манько В. М. , Руднева Т.Б./ Сборн. трудов 1 Нац. конф. РААКИ. - М., 1997. - С. 287. ; Манько В.М., Руднева Т.Б.,Разваляева Н.А./ Иммунология, 1996. -N 2. -С. 18-21), тест E-розеткообразования (E-POK) с азатиоприном у тимэктомированных мышей (Струков А.И., Чернух А.М./ БМЭ - М., 1976. - Т.4. - С. 1220 -1253). Оценка реакции рецепторов клеток на препарат in vitro в тестах спонтанного E-розеткообразования, названных нагрузочными тестами, использовалась при исследованиях полипептидного состава иммунотропных препаратов - тактивина (Арион В. Я. / Иммунобиология гормонов тимуса. - Киев: "Здоровья", 1989. - Гл. 7. -С. 103-125; Лопухин Ю.М., Арион В.Я./ Сборн. трудов 1 Нац. конф. РААКИ. - М., 1997. - С. 113-119; Arion V.Ya./ Soviet Meducal Reviews are published dy Yarwood Academic Pablished, 1989. -P. 65), у больных с хроническими заболеваниями, связанными с нарушениями противоинфекционной защиты и развитием аутоиммунных реакций (хронический бронхит, хронический пиелонефрит, ревматоидный артрит) определялся характер действия препаратов при проведении курса лечения тактивином (Алиханов Р.Б. с соавт./ Тез. докл. III Республ. Национ. Конф. "Человек и лекарство". - М., 1996. - С.64), у длительно и часто болеющих детей при использовании тактивина и тималина (Тузанкина И. А. / Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Екатеринбург, 1992), у больных с онкологическими заболеваниями использовались нагрузочные тесты с тактивином и миелопидом (Маркова Т.П./ Иммунология, 1995. -N 1.-С. 59-61), у больных с атопическими заболеваниями при изучении иммунологического эффекта димефосфона (Святкина О.Б. с соавт./ Педиатрия, 1989. -N 1.-С. 85-88), у больных с психическими заболеваниями в комплекс клинико-иммунологических показателей включалась положительная реакция лимфоцитов крови на пептиды тимуса in vitro (Краснов В.Н. с соавт./ Взаимодействие нервной и иммунной систем: Тез. докл. V Всесоюз. симп., Оренбург, 1990. - Л., Ростов н/Д., 1990. -С. 141.; Невидимова Т.И. с соавт./ Реабилитация иммунной системы: Тез. докл. II Междунар. симп., Дагомыс, 1990. - Цхалтубо, 1990. - С. 94-95).

В настоящее время находят активное применение с иммуномодулирующей целью множество препаратов, являющихся продуктами иммунной системы или их синтетическими аналогами. Мы предположили, что реакция иммунокомпетентных клеток на эти препараты может отражать изменения состояния иммунной системы и организма в целом, а значит стадию и активность патологических процессов, определение которых имеет важное значение в лечении больных, поскольку применяемый терапевтический комплекс может оказаться неэффективным, а состояние больного при данном заболевании будет оцениваться как торпидное к терапевтическим мероприятиям.

Цель изобретения - совершенствование способа диагностики активности патологических процессов, получение возможности определения различных стадий развития заболеваний одним лабораторным методом, экономичным и простым в выполнении, а также создание универсального подхода к диагностике заболеваний различной нозологической принадлежности, что основывалось на концепции единства законов развития воспалительных реакций на различные эндогенные и экзогенные агенты, индуцирующие развитие тех или иных заболеваний. Учитывая вышесказанное, способ может быть широко применим в клиниках различного профиля с минимальным лабораторным оснащением, не требующим высококвалифицированных кадров.

Идея проведения реакции E-розеткообразования лимфоцитами с различными препаратами с целью определения чувствительности к ним лимфоцитов указывалась в статьях ряда авторов (Алиханов Р.Б. с соавт. /Тез. докл. III Республ. Национ. Конф. "Человек и лекарство". - М., 1996. - С. 64; БИ, 1994, N 4, патент N 2008685; БИ, 1994, N 3, патент N 2007323; БИ, 1988, N 26, патент N 1409942; БИ, 1988, N 01, патент N 1364989; БИ, 1995, N 12, патент N 2034293; БИ, 1995, N 12, патент N 2034293; БИ, 1995, N 24, патент N 2042950; Лактионова Л.В. с соавт./ Сборн. трудов I Нац. конф. РААКИ.-М., 1997.-С. 483).

При определении чувствительности лимфоцитов к регуляторным пептидам мы использовали свою модификацию методики нагрузочных тестов с целью определения активности патологических процессов: проводится инкубация выделенной из крови лимфоцитарной взвеси в течение 90 мин с лекарственным препаратом иммуномодулирующего действия, содержащим естественные пептиды тимического или костно-мозгового происхождения, а затем после 2- минутного центрифугирования инкубация продолжается с эритроцитами барана в течение 18 ч. Подсчет индекса чувствительности (ИЧ) лимфоцитов к лекарственным препаратам определяется по формуле

Чувствительность лимфоцитов к лекарственному препарату определяется по следующему правилу:
ИЧ больше 1.0+2•σ (чувствительность положительная);
ИЧ меньше 1.0-2•σ (чувcтвитeльнocть отрицательная);
ИЧ равно 1.0±2•σ (чувcтвитeльнocть отсутствует).

σ - стандартная ошибка. Для всех исследованных препаратов σ ≈ 0.02 (см. табл. 1).

Наиболее близким аналогом изобретения является "Способ определения активности ревматического процесса" в тесте E-розеткообразования с эритроцитами барана, нагруженными антигенами миокарда или эндокарда (Дзяк Г.В. с соавт. - патент N 1534400, БИ N 1, 1990). При увеличении числа специфических E-розеткообразующих лимфоцитов с антигенами миокарда по сравнению со здоровыми от 16 до 20% при сохранении в пределах нормы числа розеток к эндокарду диагностируют миокардит. При увеличении числа розеток от 21 до 30%-эндокардит.

Существенным отличием его от предлагаемого способа диагностики является следующее:
1) определяется только наличие активности воспалительного процесса или ее отсутствие;
2) активность воспалительного процесса определяется только при конкретных нозологических формах - миокардите и эндокардите;
3) в предлагаемом способе диагностики реакция спонтанного E-розеткообразования проводится с нагрузкой пептидами (антигенами) центральных органов иммунной системы (тимуса и костного мозга), являющихся универсальными факторами, регулирующими функции иммунной системы при любых воспалительных процессах в организме, что позволяет использовать предлагаемый способ определения активности воспалительного процесса как универсальный способ диагностики; в аналоговом способе нагрузка проводится специфическими тканевыми антигенами миокарда или эндокарда, что обуславливает ограниченность диагностических возможностей.

Анализ лабораторных данных
В ходе клинико-лабораторного обследования определялась чувствительность лимфоцитов к 4 препаратам (тактивин, тималин, тимоген, миелопид) параллельно. Было обследовано 835 больных с различными типами иммунопатологии:
1) - различные виды аллергии - 230 детей (27,5% обследованных), к ним были отнесены: аллергический синдром кожный - АСК, аллергический синдром респираторный - АСР, аллергический синдром смешанный - АСС;
2) - нарушения противоинфекционной защиты 438 детей (52,5% обследованных), к ним были отнесены: бактериальные инфекции - ВИР, затяжные бактериальные инфекции - БИЗ, вирусные инфекции - ВИР, затяжные вирусные инфекции - ВИЗ, вирусно-бактериальные инфекции - ВБИ;
3) - аутоиммунные заболевания - 167 больных (20% всей группы), это больные с аутоиммунным синдромом - АУС.

Для всех пациентов и типов патологий были определены по традиционно принятому комплексу клинико-лабораторных параметров фазы и стадии патологического процесса.

Активная фаза
1. ОС - острая стадия
2. ЗОС - затяжная острая стадия
3. ПВП - постоянный вялотекущий процесс
Неактивная фаза
4. РКР - реконвалесценция ранняя
5. РКП - реконвалесценция поздняя
6. РМНС - ремиссия нестойкая
7. РМС - ремиссия стойкая
Выявлена зависимость чувствительности лимфоцитов в тестах спонтанного E-розеткообразования (E-POK) к иммунотропным препаратам от активности патологических процессов. Она отрицательна в активные периоды болезней, т.е. клетки отвечали на тимические пептиды снижением рецепторной активности, выражавшейся в уменьшении числа E-розеткообразующих клеток. При снижении активности патологических процессов наблюдалась противоположная картина: под влиянием иммунотропных препаратов активировалась E-рецепторная активность лимфоцитов, о чем свидетельствовало увеличение числа E-POK-клеток, т.е. чувствительность лимфоцитов к регуляторным пептидам тимического и костно-мозгового происхождения становилась положительной.

Результаты статистического анализа чувствительности лимфоцитов к различным препаратам для различных фаз и стадий заболеваний, различных типов патологий и возрастных групп представлены в приложении. Статистические характеристики полученной выборки в зависимости от фазы патологического процесса представлены в табл. 1 и 2. Значимость различий чувствительности лимфоцитов к 4 препаратам в активную и неактивную фазы заболеваний оценивались по t-критерию Стьюдента для независимых выборок. Предполагая некоторые отклонения от нормального распределения данных, значимость различий проверялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Для всех четырех препаратов различия между активной и неактивной фазами имеют высокую степень достоверности (P < 0.0001) и могут считаться доказанными. Аналогичный результат по значимости различий обнаружен и для разных возрастных групп (дошкольники и школьники), и разных типов иммунопатологии.

Более подробно зависимость чувствительности от фазы патологического процесса и типа патологии графически представлена на фиг. 1-4.

Фиг. 1 иллюстрирует динамику изменения чувствительности лимфоцитов к препаратам в разные стадии активности патологических процессов. Наибольшее угнетающее реакцию E-POK воздействие в активные стадии патологических процессов выявлялась у тималина. В стадию ранней реконвалесценции возрастает чувствительность к 3-м препаратам - тактивину, тимогену и миелопиду (воздействие указанных препаратов в остальные стадии заболеваний изменялось почти параллельно), а чувствительность к тималину в эту стадию еще оставалась довольно низкой, значительно возрастая по типу "скачка" при дальнейшем снижении активности процесса уже в стадию поздней реконвалесценции и, оставаясь выше других, в стадию ремиссии. Именно в этом периоде наиболее эффективно применение препаратов с целью иммуномодуляции в терапевтическом комплексе, что было показано в наших прежних исследованиях.

Фиг. 2 демонстрирует отсутствие различий в чувствительности лимфоцитов при различных видах патологических процессов при отсутствии деления их на фазы активности. Эффекты от разных препаратов практически одинаковы для всех видов патологий за исключением случаев затяжных вирусных инфекций (ВИЗ).

Фиг. 3 иллюстрирует отрицательную чувствительность лимфоцитов в активную фазу и положительную чувствительность в неактивную фазу для различных типов патологических процессов. Для всех препаратов различия фаз наиболее сильно проявляется для аллергических патологий и менее всего для аутоиммунных заболеваний.

Фиг. 4 иллюстрирует результаты сравнения фаз заболеваний для отдельных видов патологий. При затяжных вирусных инфекциях (ВИЗ) положительная чувствительность к тимогену и миелопиду может появляться раньше, чем при других иммунопатологических процессах, что может свидетельствовать о стадии ранней реконвалесценции у таких больных, которая другими клинико-лабораторными способами не может быть диагностирована. Для ВИЗ в неактивную фазу наблюдается также пониженная чувствительность к тималину.

Таким образом, статистический анализ влияния иммунотропных препаратов на спонтанную реакцию E-розеткообразования выявил статистически достоверные различия реакции клеток на регуляторные команды эндогенных пептидов, содержащихся в указанных препаратах, от стадии, т.е. от активности патологических процессов, в основе которых лежат нарушения иммунных функций и развитие воспаления, индуцируемого различными по характеру агентами. Этот факт объясняет различия в чувствительности лимфоцитов к препаратам, обнаруженные другими авторами, но неинтерпретированные ими. Назначение иммунотропных препаратов в активные стадии заболеваний противопоказано. Нами ранее замечено, что применение их в острые фазы заболеваний приводит к стойкому сохранению их угнетающих влияний на протяжении 1,5-2 месяцев, как после любого стрессорного воздействия. При этом продолжает сохраняться активность патологического процесса на протяжении всего указанного периода, а терапевтические мероприятия становятся малоэффективными.

Сравнительный анализ действия исследованных иммуномодуляторов дает возможность осуществлять преимущественный выбор лекарственного препарата для проведения иммуномодуляции с максимальным эффектом от его применения. Так, в группе больных с аллергической патологией таким препаратом может стать тактивин, в группе больных с аутоиммунной патологией - тималин, и наименьших отрицательных воздействий можно ожидать при применении миелопида.

Изобретение относится к медицине, а именно - к лабораторной диагностике иммунологическими методами, и может быть использовано в иммунологической диагностике различных патологических состояний. Способ позволяет определять различные стадии развития заболеваний, используя реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана и в присутствии препаратов иммуномодулирующего действия, содержащих естественные регуляторные пептиды тимического и костно-мозгового происхождения. Вычисляется индекс чувствительности лимфоцитов к препаратам, который определяет индекс активности патологических процессов. Техническим результатом является создание способа диагностики заболеваний различной нозологической принадлежности, а также возможность осуществлять преимущественный выбор лекарственного препарата для проведения иммуномодуляции с максимальным эффектом от его применения. 2 табл., 4 ил.

Способ определения активности патологического процесса в тестах оценки функциональной активности лимфоцитов в реакции Е-розеткообразования, отличающийся тем, что используют инкубацию выделенной из крови лимфоцитарной взвеси в течение 90 мин с лекарственным препаратом иммуномодулирующего действия, содержащим естественные пептиды тимического или костно-мозгового происхождения, а затем, после 2-минутного центрифугирования, инкубацию продолжают с эритроцитами барана в течение 18 ч, а затем рассчитывают индекс чувствительности (ИЧ) по формуле

и при значении ИЧ больше 1,0+2σ активность патологического процесса оценивают как низкую, при этом чем выше значение ИЧ, тем активность считают менее выраженной, а при ИЧ меньше 1,0-2σ констатируют активный патологический процесс, при этом чем меньше значение ИЧ, тем активность процесса считают более выраженной, а при значении ИЧ, равном 1,0±2σ, констатируют отсутствие чувствительности к лекарственному препарату, где σ - стандартная ошибка, равная 0,02.