СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам количественного определения бактериальных липополисахаридов в процессе производства медицинских иммунобиологических препаратов.

Известен колориметрической способ количественного определения липополисахаридов с использованием триазинового красителя 1,9-диметилметиленового голубого (Keler T., Nowotny A. Metachromatic assay for the quantitative determination of bacterial endotoxins // Anal. Biochem. - 1986. - Vol. 156. - P. 189-193). Последний, взаимодействуя с липополисахаридами, смещает максимум поглощения в более коротковолновую область, что может быть количественно измерено с помощью спектрофотометра. Недостатком способа является то, что количественное определение липополисахаридов затруднено в присутствии белков и нуклеиновых кислот.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ определения липополисахаридов с помощью карбоцианинового красителя 1-этил-2[3-(1-этилнафто[1,2] -тиазолни-2-илиден)-2-метилпропенил] нафто[1,2-d]тиазолий бромида (Janda J., Work E. A colorimetric estimation of LPS // FEBS Lett. - 1971. - Vol. 16. - P. 343-345). При взаимодействии указанного карбоцианинового красителя с липополисахаридами происходит смещение максимума его поглощения в более коротковолновую область (от 510-515 нм к 470-480 нм).

Описана модификация данного способа (Михеева М.Н., Брутко Л.И. Применение карбоцианиновых красителей в анализе бактериальных липополисахаридов (эндотоксинов). II. Липополисахарид Salmonella typhi / Химия природн. соед., 1977, N 6, с. 790-792), отличающаяся тем, что краситель растворяли в этаноле, а не в диоксане. Авторы этой модификации исходили из того, что максимум поглощения свободного карбоцианинового красителя 1-этил-2[3-(1-этилнафто[1,2] -тиазолин-2-илиден)-2-метилпропенил] нафто[1,2-d] тиазолий бромида в 30%-ном водном этаноле находится в области 573 нм, а ассоциата красителя с липополисахаридом в области 467 нм. Поэтому они использовали в качестве контроля воду, а не раствор красителя, как рекомендуют J. Janda, E. Work. Однако ранее R. E. Kay с соавт. (Kay R.E., Walwick E.R., Gifford C.K. Spectral changes in a cationic dye due to interaction with macromolecules. I. Behavior of dye alone in solution and the effect of added macromolecules // J. Phys. Chem. - 1964. - Vol. 68. - P. 1869-1906) показали, что данный карбоцианиновый краситель в 30%-ном водном этаноле имеет еще один максимум поглощения в области 533 нм, а при более низких концентрациях этанола он смещается к 510 нм. Аналогичные результаты были получены и нами. Наличие максимума поглощения при 533 нм и тем более при 510 нм не позволяет удовлетворительно разделить пики поглощения свободного карбоцианинового красителя и его ассоциата с липополисахаридом, что делает непригодным данную модификацию способа, выбранного в качестве прототипа, для количественного анализа липополисахаридов. Тем более, что отсутствие буферных веществ, поддерживающих кислое значение pH реакционной среды, не позволяет проводить оценку содержания липополисахаридов в присутствии белков и нуклеиновых кислот.

Недостатками способа-прототипа являются:
1. Нестабильность раствора красителя как на свету, так и в темноте, в результате чего возникает необходимость использовать свежеприготовленный реагент перед каждым определением.

2. Нестабильность продукта взаимодействия карбоцианинового красителя с липополисахаридами, особенно сильно проявляющаяся на свету, и связанные с этим трудности количественных оценок.

3. Узкий интервал линейной зависимости оптической плотности ассоциата карбоцианинового красителя с липополисахаридами от количества липополисахаридов в пробе (от 0,5 до 10 мкг липополисахаридов).

4. Несоответствие содержания свободного красителя в контрольной и опытной пробах. В последней часть свободного красителя переходит в ассоциат карбоцианинового красителя с липополисахаридом и в тем большей степени, чем выше концентрация липополисахарида в пробе. Так как пики поглощения свободного красителя и его ассоциата с липополисахаридом перекрываются, то избыточный краситель в контрольной пробе оказывает влияние на величину и форму пика поглощения ассоциата, о чем и свидетельствует резкий обрыв пика ассоциата в длинноволновой части (см. Janda J., Work E. A colorimetric estimation of LPS // FEBS Lett. - 1971. - Vol. 16. - P. 343-345).

Целью изобретения является повышение стабильности процедуры определения липополисахаридов в медикоиммунобиологических препаратах и упрощение ее проведения.

Указанная цель достигается тем, что 0,1 мл 0,2%-го раствора карбоцианинового красителя 1-этил-2[3-(1-этилнафто[1,2]-тиазолин-2-илиден)-2-метилпропенил] нафто [1,2-d]тиазолий бромида в формамиде и буферный раствор pH 3,8-4,5 непосредственно добавляют к испытуемой пробе липополисахарида и вводится раствор сульфита натрия до конечной концентрации 0,05-0,4 М.

Замена диоксана на формамид обусловлена тем, что раствор карбоцианинового красителя в диоксане менее стабилен, чем в формамиде. Растворы карбоцианинового красителя в формамиде различных концентраций могут храниться в холодильнике в течение нескольких недель без изменений. Растворимость карбоцианинового красителя в формамиде во много раз больше, чем в диоксане, это значительно сокращает и облегчает процедуру приготовления красящего реагента.

Введение буферного раствора непосредственно в реакционную среду, а не в состав раствора красителя, связано с возрастанием нестабильности красителя в присутствии воды. Интервал выбранных значений pH 3,8-4,5 обусловлен необходимостью блокирования отрицательных зарядов белков, нуклеиновых кислот и других полианионов нелипополисахаридной природы. При более высоких значениях pH появляющиеся отрицательные заряды на других макромолекулах будут взаимодействовать с положительными зарядами карбоцианинового красителя, препятствуя проведению анализа. При pH ниже 3,8 резко снижается стабильность ассоциата карбоцианинового красителя с липополисахаридом.

Введение раствора сульфита натрия преследует двоякую цель. Поскольку пики поглощения карбоцианинового красителя и его ассоциата с липополисахаридом перекрываются, то желательно сместить максимум поглощения свободного красителя в более длинноволновую область. Эта задача достигается введением раствора сульфита натрия до конечной концентрации его в реакционной среде 0,05-0,4 М (чертеж). Попутно решается другая задача: возрастает стабильность ассоциата карбоцианинового красителя с липополисахаридом, так что при соблюдении оптимальных условий проведения реакции величина оптической плотности ассоциата изменяется не более, чем на 5% даже через 24 ч.

На чертеже изображены спектры поглощения карбоцианинового красителя без (1) и с добавлением в раствор сульфита натрия (2).

Способ осуществляют следующим образом.

К 1,0 мл раствора, содержащего от 1 до 100 мкг липополисахаридов, добавляют 0,4 мл 0,1 н. натрий-ацетатного буферного раствора pH 4,0 1,3 мл дистиллированной воды и 0,1 мл 0,2%-го раствора карбоцианиновго красителя в формамиде, перемешивают, помещают в темноту при комнатной температуре на 45 мин, после чего добавляют 0,2 мл 1 М раствора сульфита натрия. Спустя 15 мин измеряют абсорбцию полученного раствора, содержащего комплекс карбоцианинового красителя с липополисахаридом, на спектрофотометре при длине волны, соответствующей максимуму поглощения комплекса, против контрольной пробы. Контрольная проба готовится так же как и опытная за исключением того, что вместо 1,0 мл раствора липополисахарида берут 1,0 мл дистиллированной воды, количество раствора карбоцианинового красителя снижает до 0,025 мл и вводят микропипеткой 0,075 мл формамида. Максимум поглощения комплекса карбоцианинового красителя с липополисахаридом зависит от вида определяемого липополисахарида и колеблется в интервале 465-475 нм. Поэтому величину абсорбции опытных проб измеряют при длине волны, которая соответствует максимуму поглощения исследуемого липополисахарида.

Расчет концентрации липополисахаридов в опытной пробое проводят по кривой зависимости оптической плотности растворов очищенного препарата исследуемого липополисахарида от их концентрации в интервале от 1 до 100 мкг/мл.

Изобретение иллюстрируется примерами определения концентрации липополисахарида Vibrio cholerae eltor M-878 (серовар Инаба).

Построение калибровочной кривой
В пробирки наливают по 1 мл водных растворов холерного липополисахарида, выделенного и очищенного по методу Г.А. Адамса (Адамс Г.А. Выделение липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Методы исследования углеводов: пер. с англ. - М.: 1975, с. 126-130), с концентрацией 10, 50, 100 мкг/мл, добавляют по 0,4 мл 01 н. натрий-ацетатного буферного раствора pH 4,0 1,3 мл дистиллированной воды, 0,1 мл 0,2%-го раствора карбоцианинового красителя в формамиде, перемешивают, выдерживают в темноте 45 мин и добавляют по 0,2 мл 1 М раствора сульфита натрия. Реакцию проводят в трех повторностях. Спустя 30 мин измеряют оптическую плотность при 467 нм против контрольной пробы (не содержащий липополисахарида). Средние величины оптической плотности из трех повторностей составляют: 0,137 (10 мкг липополисахарида), 0,725 (50 мкг липополисахарида), 1,460 (100 мкг липополисахарида). Строят график зависимости оптической плотности растворов препарата холерного липополисахарида от их концентрации.

Пример 1. К 1 мл водного раствора, содержащего неизвестное количество холерного липополисахарида, добавляют 0,4 мл 0,1 н. натрий-ацетатного буферного раствора pH 3,8, 1,3 мл дистиллированной воды, 0,1 мл 0,2%-го раствора карбоцианинового красителя в формамиде, перемешивают, выдерживают в темноте 45 мин и добавляют 0,2 мл 0,75 М раствора сульфита натрия. Реакцию проводят в трех повторностях. Спустя 15 мин измеряют оптическую плотность при 467 нм против контрольной пробы (не содержащей липополисахарида). Средняя величина оптической плотности равна 0,630, что по калибровочной кривой соответствует 46 мкг липополисахарида в 1 мл испытуемого раствора.

Пример 2. К 1 мл вышеупомянутого (см. пример 1) водного раствора липополисахарида, содержащего неизвестное количество холерного липополисахарида, добавляют 0,4 мл 0,1 н. натрий-ацетатного буферного раствора pH 4,0, 1,3 мл дистиллированной воды, 0,1 мл 0,2%-го раствора карбоцианинового красителя в формамиде, перемешивают, выдерживают в темноте 45 мин и добавляют 0,2 мл 1 М раствора сульфита натрия. Реакцию проводят в трех повторностях. Спустя 15 мин измеряют оптическую плотность при 467 нм против контрольной пробы (не содержащей липополисахарида). Средняя величина оптической плотности равна 0,704, что по калибровочной кривой соответствует 50 мкг липополисахарида в 1 мл испытуемого раствора.

Пример 3. К 1 мл вышеупомянутого (см. пример 1) водного раствора холерного липополисахарида добавляют 0,4 мл 0,1 н. натрия-ацетатного буферного раствора pH 4,5, 0,7 мл дистиллированной воды, 0,1 мл 0,2%-го раствора карбоцианинового красителя в формамиде, перемешивают, выдерживают в темноте 45 мин и добавляют 0,8 мл 1,5 М раствора сульфита натрия. Реакцию проводят в трех повторностях. Спустя 15 мин измеряют оптическую плотность при 467 нм против контрольной пробы (не содержащей липополисахарида). Средняя величина оптической плотности равна 0,640, что по калибровочной кривой соответствует 47 мкг липополисахарида в 1 мл испытуемого раствора.

В результате упрощается процедура приготовления раствора красителя, возрастает его стабильность. Становится возможным его хранение в холодильнике в течение трех-четырех недель без потери реакционной способности. Исключается необходимость введения в состав красителя неустойчивого раствора аскорбиновой кислоты, который используется только свежеприготовленным. Возрастает стабильность окрашенного комплекса ЛПС с карбоцианиновым красителем, что позволяет проводить его спектрофотометрирование в течение 1-5 ч со снижением оптической плотности не более чем на 3-5%. Это позволяет проводить одновременно анализ большого количества образцов.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам количественного определения бактериальных липополисахаридов в процессе производства медицинских иммунобиологических препаратов. Раствор карбоцианинового красителя (1-этил-2[3-(1-этилнафто[1,2] -тиазолин-2-илиден)-2-метилпропенил] нафто[1,2-d] тиазолий бромида) в формамиде и буферный раствор вводят непосредственно в испытуемый образец липополисахаридов и добавляют раствор сульфита натрия. В результате упрощается процедура приготовления раствора красителя, возрастает его стабильность. Становится возможным его хранение в холодильнике в течение трех-четырех недель без потери реакционной способности. Исключается необходимость введения в состав красителя неустойчивого раствора аскорбиновой кислоты, который используется только свежеприготовленным. Возрастает стабильность окрашенного комплекса липополисахарида с карбоцианиновым красителем, что допускает проведение его спектрофотометрирования в течение 1 - 5 ч со снижением оптической плотности не более, чем на 3 - 5%. Это позволяет проводить одновременно анализ большого количества образцов. 1 ил.

Способ определения бактериальных липополисахаридов путем формирования окрашенного комплекса карбоцианинового красителя 1-этил-2[3-(1-этилнафто[1,2] -тиазолин-2-илиден)-2-метилпропенил] нафто[1,2-d] тиазолий бромида с липополисахаридом, при котором к образцу липополисахарида добавляют карбоцианиновый краситель в буферном растворе с последующим измерением величины оптической плотности раствора при 465 - 475 нм и расчетом концентрации липополисахарида по калибровочной кривой, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности процедуры определения липополисахаридов в медикоиммунобиологических препаратах и упрощения ее проведения, 0,1 мл раствора красителя концентрацией 0,2% в формамиде и буферный раствор pH 3,8 - 4,5 непосредственно добавляют к испытуемой пробе липополисахарида и вводят раствор сульфита натрия до конечной концентрации 0,05 - 0,4 М.