СПОСОБ ОБРАБОТКИ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу обработки цельной крови для выявления ДНК M.tuberculosis (МВТ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Рост заболеваемости туберкулезом и прямая зависимость эффективности лечения больных от сроков его выявления делают задачу ранней и специфической диагностики этого заболевания одной из наиболее актуальных проблем современной фтизиатрии.

В последние годы для этих целей наряду с общепринятыми микробиологическими методами во фтизиатрии широкое применение нашел современный молекулярно-генетический метод - полимеразная цепная реакция, который зарекомендовал себя как наиболее быстрый, чувствительный и специфический тест выявления ДНК МБТ. Метод основан на многократном копировании определенного фрагмента ДНК МБТ с помощью специально подобранных праймеров и фермента ДНК-полимеразы. Материалом для выявления ДНК МБТ методом ПЦР являются различные биологические секреты, получаемые от больных с легочной и внелегочной патологией.

Особый интерес для выявления ДНК МБТ представляет периферическая кровь, как наиболее реальный секрет для скрининга населения на предмет массового выявления случаев заболевания туберкулезом. Важнейшим фактором, влияющим на выявляемость ДНК МБТ с помощью метода ПЦР в крови, является метод обработки первичного материала, особенно - освобождение от гемоглобина. Для этой цели используют различные варианты пробоподготовки материала для деконтаминации, освобождения от эритроцитов и гемоглобина, а также применяют различные реагенты для дальнейшего разрушения микробной клетки.

Таким образом, аналогом данного изобретения является способ выявления ДНК МБТ методом ПЦР в крови, полученной от больных туберкулезом с внелегочной и легочной локализацией (Fobes В., Hicks К. // J. Clin. Microbiol. - 1993. - v.31. - р.1688-1691; Folgueira L., Delgado R., Palenque E. et al. // Neurology. - 1994. - v.44. p.1336-1338; Gamboa F., Fernandez G., Paolilla E. et al.// J. Clin. Microbiol. - 1998. - v.36. - p.684-689).

Выявляемость ДНК МБТ в периферической крови в этих исследованиях варьировала в достаточно широких пределах от 50% до 85%, в зависимости от способа обработки материала, формы туберкулеза и длительности лечения.

Прототипом данного изобретения является совокупность способов обработки крови и освобождения осадка от гемоглобина, которые можно применять для дальнейшего выявления ДНК МБТ различными ПЦР тест-системами.

1. Как и для любого клинического материала, для крови существуют различные варианты обработки с последующим выделением ДНК МБТ. Для этих целей используются: SDS, дистиллированная Н₂О, NaOH/NaLC, NH₄Cl, в различных соотношениях с клиническим образцом, на разных этапах обработки образца. Каждый из методов обработки крови имеет как свои достоинства, так и недостатки.

В большинстве работ для выделения ДНК МБТ используют лимфоцитарную фракцию (которую выделяют с помощью фикола), плазма при этом не анализируется, что может приводить к определенной потере микробных клеток, которые могут находиться в крови во внеклеточной среде. Нами было показано, что в случаях, когда у одного и того же больного выделяли ДНК из лимфоцитарной фракции и из цельной крови, выявление МБТ в цельной крови происходит в большем проценте случаев, чем по отдельности: в лимфомоноцитарной фракции и плазме крови.

2. Следующим недостатком методов является забор большого количества венозной крови, до 20 мл (Aguado J.// Lancet 1996. - v.347. - р.1836-1837; Folgueira L., Delgado R., Palenque E. et al.// J. Clinical Microbiology. - 1996. - p.512-515; Gamboa F., Manterola J., Lonca J. // Int. J. Tubercle and Lung Disease.- 1997. - v.1. - p.542-555; Stauffer F., Haber H., Rilger A. et al.// J. Clin. Microbiol.- 1998. - v.36. - p.614-617; Херрингтон С., Макги Д.// Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир. 1999. с.305-306.)

Во всех этих работах самые маленькие объемы крови, используемые для выявления ДНК МБТ, составляют 5 мл. Надо отметить, что чем больше объем крови, тем сложнее процесс освобождения от гемоглобина. В наших исследованиях было показано, что в случаях, когда больной является бацилловыделителем, 500-700 мкл крови необходимо и достаточно для выявления ДНК.

3. В качестве систем, лизирующих эритроциты, нами были исследованы три вида реагентов: NH₄Cl, NaOH/NaLC, Н₂О с добавлением их в образец с кровью в различных концентрациях. Наилучшие показатели (в плане лизирования эритроцитов) были получены со следующими реагентами: 0,085% NH₄Cl, (v:v кровь-реагент 1:10 и 2%NaOH/0,125%NaLC 5:1, соответственно). Разрушенные эритроциты с гемоглобином в осадке после обработки данными реагентами присутствуют в меньшей степени, чем при использовании других вариантов обработки. Условия соотношения объемов образца и реагента подобраны впервые, и аналогов в литературе нет. В результате, метод лизирования эритроцитов крови занимает минимальное время (30-40 мин) по сравнению с методами, приводимыми в литературе. К крови добавляется реагент в нужной концентрации, выдерживается 20 мин при комнатной температуре и центрифугируется 10 мин при 5000 об/мин (большее количество оборотов при центрифугировании усложняет процедуру отмывки от гемоглобина).

4. В качестве систем, отмывающих от гемоглобина, были исследованы различные концентрации SDS, ЭДТА, тритона в 10 мМ Трис НСl и 1 мМ ЭДТА, (рН 7,6) и фосфатно-солевой буфер. Наилучшие результаты отмывания осадка от гемоглобина были получены при использовании 1% тритона в буфере 10 мМ Трис HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 7,6). Как правило, двукратное отмывание осадка бывает достаточным для получения чистого осадка клеток.

Дальнейшее прогревание осадка в этой же буферной системе (рН 8,0) в течение 10 мин при 95°С с последующим охлаждением, является достаточным для разрушения клеток и выделения ДНК. Полученный раствор ДНК можно использовать для ПЦР реакции.

Таким образом, предлагаемая система обработки крови, включающая стадии разрушения эритроцитов, отмывания осадка от гемоглобина и выделения ДНК в совокупности вышеупомянутых условий, предложена впервые, является быстрой (обработка в течение часа) и эффективной для получения ДНК из МБТ.

Отличия предлагаемого нами способа от способов, применяемых другими исследователями, состоят в следующем. Используется меньший объем цельной венозной крови (0,5 мл), что вполне достаточно для детекции ДНК МБТ методом ПЦР. При работе с таким объемом крови упрощается и сокращается время процедуры отмывки от гемоглобина. Для лизиса эритроцитов используются общепринятые реагенты для первичной обработки респираторных и некоторых не респираторных образцов. От гемоглобина освобождаются с помощью реагента, который и в дальнейшем используют для выделения ДНК МБТ и который не препятствует дальнейшему проведению реакции амплификации. В результате, за короткое время, используя один и тот же набор реагентов, в одной пробирке можно провести пробоподготовку образцов крови с последующим выделением ДНК МБТ.

С целью определения выявляемости ДНК МБТ в образцах крови методом ПЦР, обработанных с применением данных детергентов, была проведена серия опытов. Первоначально, образцы крови с антикоагулянтом, полученные от больных туберкулезом и здоровых доноров, разливали по пробиркам в количестве 0,5 мл. К ним добавляли культуру M.tuberculosis Н37 RV, которую разводили по стандарту мутности Макфарланда с конечной концентрацией 150×10⁶ кл/мл. После дальнейшего разведения пробы с кровью содержали M.tuberculosis в следующих концентрациях: 150-100; 75-50 и 10-8 клеток в пробе. Далее кровь обрабатывали согласно предлагаемому способу: к 500 мкл крови добавляли 100 мкл NAOH/NaLC используемой концентрации, выдерживали 20 мин при комнатной температуре, цетрифугировали при 5000 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость отбрасывали. Затем осадок промывали дважды раствором 1% тритона в 10 мМ ТрисНСl и 1 мМ ЭДТА (рН 7,6), затем добавляли 20 мкл этого же буфера (рН 8,0) и прогревали 10 мин при 95°С. Далее ПЦР проводили с помощью собственной тест-системы “Нестед-ПЦР” (Патент №2163022 от 04.07.2001), хотя на этом этапе можно использовать и другие тест-системы.

Метод пробоподготовки сохраняет высокую чувствительность, поскольку для анализа из образцов забирается 2 мкл, что по содержанию ДНК эквивалентно единичным клеткам МБТ.

Затем проводили исследования по выявлению ДНК МБТ в периферической крови, обработанной данными реагентами, на образцах, полученных от больных с разными формами туберкулеза и находящихся на лечении в МНПЦБТ. Были исследованы образцы крови от 42 больных. Двадцать девять из них находились в активной фазе заболевания (до одного месяца лечения), у 24 (82,7%) из которых была выделена ДНК МБТ из крови.

Таким образом, исследования показали высокую выявляемость ДНК МБТ в периферической крови методом ПНР у больных в активную фазу заболевания.

Преимуществом предложенного метода, по сравнению с имеющимися в литературе, являются следующие позиции:

1. Высокий процент выявляемости (свыше 82% у больных в активную фазу заболевания).

2. Быстрота и простота подготовки образца (1-1,2 часа и две смеси реагентов), все операции можно проводить в одной пробирке.

3. Специфичность, выявляются только микобактерии, поскольку при подготовке проб применяются реагенты, убивающие туберкулезную микрофлору.

Изобретение относится к медицине и касается способа подготовки образца крови для выявления ДНК M.tuberculosis методом полимеразной цепной реакции. Способ включает лизис эритроцитов и отмывание осадка от гемоглобина с дальнейшим применением отмытого осадка для выделения ДНК и определения ее наличия методом полимеразной цепной реакцией. Для лизиса эритроцитов используют раствор NaOH/NaLC, применяемый и ранее, но в соотношении, не допускающем образования сгустков и сворачивания крови, а именно кровь: 2%NaOH/0,125%NaLC, 5:1. Освобождение осадка от гемоглобина производят буфером 10 мМ Трис HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 7,6) с 1% тритоном. Преимущество изобретения заключается в ускорении подготовки пробы и уменьшении образца крови от больного без уменьшения чувствительности при постановке ПЦР.

Способ обработки цельной крови для выявления ДНК M.tuberculosis методом полимеразной цепной реакции, включающий лизис эритроцитов и отмывание осадка от гемоглобина, отличающийся тем, что в качестве лизирующей системы используют смесь 2%NaOH/0,125%NaLC, которую добавляют в кровь в соотношении кровь:лизирующая система 5:1, смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин, после чего осадок промывают дважды 1% тритоном в буфере 10 мМ Трис HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 7,6).