ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СУБСТАНЦИЙ В МОЧЕ Российский патент 2001 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/04 C12Q1/18 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано при бактериологическом исследовании мочи.

В клинической практике бактериологическая диагностика уроинфекций должна включать наряду с определением степени бактериурии постановку теста на присутствие в моче антибактериальных субстанций. Это связано с тем, что в случае проведения микробиологических исследований мочи после начала лечения антибактериальными препаратами нередко нельзя обнаружить возбудитель в моче, несмотря на явно протекающий патологический процесс в организме больного. После завершения курса лечения также необходима постановка теста на наличие антибактериальных субстанций в моче с целью установления достоверности результатов бактериологических исследований [1].

Известно определение антибактериальных субстанций в биологических жидкостях и тканях с использованием различных питательных сред и тест-систем [2, 3].

Недостатком указанных сред и тест-систем является низкая чувствительность, длительность определения, многокомпонентность состава, трудоемкость приготовления и высокая стоимость.

Наиболее близким решением задачи того же назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является уротест-система АБ [4], состоящая из носителя спор, пропитанного забуферной питательной средой, энзиматическим субстратом - глюкозидом и спорами тест-штамма В. subtilis АТСС 6051.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной тест-системы, принятой за прототип, является ее низкая чувствительность, позволяющая регистрировать только высокие концентрации антибактериальных веществ в моче, что ограничивает ее использование в клинической практике. Недостатком системы является также необходимость использования в качестве энзиматического субстрата дорогостоящего глюкозида.

Задача предлагаемого изобретения - повышение чувствительности тест-системы и удешевление ее стоимости.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит в качестве носителя крахмал, в качестве питательной среды - дрожжевой экстракт, в качестве энзиматического субстрата - глюкозу, в качестве буферной системы - натрий фосфорнокислый двузамещенный и натрий углекислый, в качестве индикатора кислотообразования - феноловый красный при следующем соотношении компонентов, г/л:
Крахмал - 0,8 - 1,6
Споры тест-штамма В.subtilis АТСС 6051 - 5,71 · 10⁸ - 11,42 · 10⁸
Дрожжевой экстракт - 3,0 - 6,0
Глюкоза - 10,0 - 20,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,6 - 0,8
Натрий углекислый - 0,13 - 0,15
Феноловый красный - 0,03 - 0,06
Вода дистиллированная - До 1 л
Тест-систему получают следующим образом.

Пример 1. Штамм B.subtilis АТСС 6051 пересевают на скошенный питательный агар и ингибируют при 37^oC в течение 18-20 ч. Выращенную культуру смывают 5-10 мл стерильной дистиллированной воды и вносят в матрац на поверхность скошенного питательного агара. Засеянный матрац инкубируют в термостате при 37^oC в течение 5-7 суток, по окончании инкубирования производят микроскопический контроль и, если в мазках, окрашенных по ГРАМу, имеется в поле зрения 80-90% спор, делают смыв культуры стерильной дистиллированной водой. Полученную взвесь прогревают при 60-70^oC в течение 30 мин. Затем промывают 3 раза дистиллированной водой при центрифугировании до полной прозрачности. Промытую взвесь спор вновь прогревают в течение 30 мин при 60-70^oC. Определяют количество спор в 1 мл по оптическому стандарту мутности.

Крахмал высушивают при 100-120^oC в течение 10-12 ч до содержания влаги 1-2%, а затем стерилизуют при 160-170^oC в течение 4 ч. В фарфоровую ступку, предварительно обработанную спиртом и высушенную на воздухе, вносят 14 г крахмала и 1 мл взвеси, содержащей 10 млрд спор, смесь тщательно растирают в ступке в течение 5 мин. Далее в 0,5 л дистиллированной воды последовательно растворяют 0,8 г крахмала, содержащего 5,71·10⁸ спор тест-штамма B.subtilis АТСС 6051, 3 г дрожжевого экстракта, 10 г глюкозы, 0,6 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,13 г натрия углекислого, 0,03 г фенолового красного, объем смеси доводят дистиллированной водой до 1 л.

Смесь разливают в стерильные пробирки по 1 мл, выдерживают на водяной бане при 53+2^oC в течение 15 мин. Затем в пробирки добавляют по 1 мл раствора антибиотиков различной концентрации. В контрольные пробирки добавляют по 1 мл стерильной дистиллированной воды. Учет результатов производят через 18-24 ч инкубации в термостате при 37^oC.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в 0,5 л дистиллированной воды растворяют 1,2 г крахмала, содержащего 8,56·10⁸ спор тест-штамма В.subtilis АТСС 6051, 4,5 г дрожжевого экстракта, 15 г глюкозы, 0,7 г натрия фосфорнокислого, 0,14 г натрия углекислого, 0,045 г фенолового красного, объем смеси доводят дистиллированной водой до 1 л. Далее - согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примеров 1 и 2 тем, что в 0,5 л воды растворяют 1,6 г крахмала, содержащего 11,42·10⁸ спор тест-штамма В.subtilis АТСС 6051, 6 г дрожжевого экстракта, 20 г глюкозы, 0,8 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,15 г натрия углекислого, 0,06 г фенолового красного, объем смеси доводят водой до 1 л. Далее - согласно примеру 1.

Результаты сравнительного изучения чувствительности предлагаемой и известной тест-систем представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая тест-система обладает высокой чувствительностью, способна улавливать низкие концентрации антибиотика в среде (15 ед. /мл). Известная тест-ситема обладает слабой чувствительностью, позволяет регистрировать только высокие концентрации антибиотика в растворе (250 ед. /мл), что в 16 раз ниже чувствительности предлагаемой тест-системы.

Кроме того, заявленная тест-система не содержит дорогостоящего глюкозида, она удобна для рутинных исследований, поскольку не предъявляет никаких особых требований ни к месту выполнения, ни к исследователю, выполняющему анализ, экономически выгодна, т.к. из 1 л можно выполнить тысячу анализов.

Литература
1. Arbeitsanleitungen Klinische chemie. Diagnostica Merck. Hemstoff-Test in Harn., 1992, s. 123-124.

2. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. /Под ред. Биргера М.О. - М.: Медицина, 1982, с. 172-180.

3. Microbiology Manual Merck, 1990, s. 201-204.

4. Microbiology Manual Merck, 1990, Urotest AB, s. 282-283 (прототип).

Изобретение относится к медицине. Может быть использовано при бактериологическом исследовании мочи. Тест-система содержит в качестве носителя спор крахмал, в качестве питательной среды - дрожжевой экстракт, в качестве энзиматического субстрата - глюкозу, в качестве буферной системы - натрий фосфорнокислый двузамещенный и натрий углекислый, в качестве индикатора кислотообразования - феноловый красный. Тест-микроорганизм представлен спорами штамма В. subtilis АТСС 6051. Преимущество данной тест-системы в повышенной чувствительности и удешевлении ее стоимости. 1 табл.

Тест-система для определения антибактериальных субстанций в моче, содержащая носитель спор, питательную среду, энзиматический субстрат, буферную систему, споры тест-штамма Bacillus subtilis ATCC 6051, отличающаяся тем, что она в качестве носителя спор содержит крахмал, в качестве питательной среды дрожжевой экстракт, в качестве энзиматического субстрата - глюкозу, в качестве буферной системы - натрий фосфорнокислый двузамещенный и натрий углекислый, дополнительно содержит дистиллированную воду и индикатор кислотообразования феноловый красный при следующем соотношении компонентов, в г/л:
Крахмал - 0,8 - 1,6
Споры тест-штамма Bacillus subtilis ATCC 6051 - 5,71 · 10⁸ - 11,42 · 10⁸
Дрожжевой экстракт - 3,0 - 6,0
Глюкоза - 10,0 - 20,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,6 - 0,8
Натрий углекислый - 0,13 - 0,15
Феноловый красный - 0,03 - 0,06
Вода дистиллированная - До 1 л