Двуслойная питательная среда для родовой идентификации энтеробактерий Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается родовой идентификации энтеробактерий.

Цель изобретения - повышение дифференцирующих свойств среды.

Среду готовят следующим образом.

Навески веществ (нижний слой) вносят в 300 мл дистиллированной воды, кипятят 2-3 мин., охлаждают до 50 С и прибавляют стерильно 2,4 мл 50%-ной мочевины (1,2 г), выдержанной 2-3 сут

для самостерилизации, разливают по 2 мл и охлаждают в виде столбика.

Навеску веществ верхнего слоя вносят в 700 мл дистиллированной воды, кипятят 2-3 мин, охлаждают до 50°С и разливают пен 4,5 мл поверх застывшего ниадегб слоя и скашивают, оставляя столбик в 2 смо

Подготовка тест-штаммов к посеву.

Тест-штаммы энтеробактерий сохраняют в лиофилизированном состоянии или

на питательной среде следующего состава, г/л:

Питательный бульон сухой 1,5 Натрий хлористый5,0

Микробиологический агар рН 7,2±0,2 Культуры тест-штаммов, со среды хранения пересевают на скошенный питательный агар и выращивают 18-24 ч при 37°С. Далее по 1 бактериологической петле диаметром 2 мм культуры каждого тест-штамма энтеробактерий вносят в 3 пробирки с испытуемой средой. Посев проводят вначале по скошенной части в виде прямой линии, затем в толщу агарового столбика и заканчивают по скошенному агару штрихом. Причем угол в толщу агарового столбика не должен достигать дна с тем, чтобы не нарушались условия для сбраживания глюкозы в относительно анаэробных условиях. Контрольную пробирку оставляют незасеянной. Примеры использования среды.

П р и р 1. Приготовление нижнего слоя среды.

О,1 г экстракта кормовых дрожжей, 25 г пептона, 1,0 г глюкозы, 1,9 г тиосульфата натрия, 1,0 г агара, 2,0 г обезвоженного динатрийфосф ата, 0,02 фенолового красного, 0,001 бриллиантового зеленого растворяют в 300 мл дистиллированной воды, доводят до полного растворения при кипячении в водяной бане в течение 2-3 мин, охлаждают до 50°С. Прибавляют 2,2 мл 50%-ного водного раствора мочевины .(1,1 г), приготовленной за три и более дней до использования, среду тщательно размешивают, стерильно разливают по 2 мл в пробирки, остуживают столбиком поверх которого наливается верхний слой данной среды.

Приготовление верхнего слоя среды, дз 0,2 г экстракта кормовых дрожжей, 8,0 г лактозы, 5,8 г микробиологического агара, 4,5 г обезвоженного динат- рийфосфата, 0,49 г соли Мора, 0,056 г фенолового красного, 0,4 г алкшпЗен- п золсульфат натрия растворяют в 700 мл дистиллированной воды. Устанавливают рН 7,4±0,3. Среду кипятят 3-5 мин, охлаждают до 50°С, разливают асептич- в пробирки по 4,5 мл поверх за- стывшего нижнего слоя среды и скаши- вают, оставив столбик высотой до 2см. Готовую среду можно хранить при 4 С до трех недель.

0

5

0

5

з п

0

5

0

Через 19 ч инкубации при 37СС определяют наличие роста культур, стабильность их биологических свойств, дифференцирующие свойства среды.

О ферментации, лактозы на разработанной среде судят по изменению цвета агара в скошенной части, а о ферментации глюкозы - в нижнем столбике, в котором при газообразовании появляются пузырьки (разрывы среды или ее отслоение от стенок пробирки).

Образование сероводорода устанавливают по почернению верхнего столбика среды (в виде кольца). При росте культуры, гидролизующей мочевину, скошенная часть среды приобретает ярко малиновый цвет.

Исключение составляют протеи. В этом случае вся среда приобретает ярко-малиновый цвет за счет интенсивного расщепления мочевины.

Пример 2„ Отличается от примера 1 тем, что в 300 мл дистиллированной воды вносят для приготовления нижнего слоя среды 0,15 г экстракта кормовых дрожжей, 3,0 г пептона, 1,2 г глюкозы, 2,04 г тиосульфата натрия, 1,5 г агара, 2,1 обезвоженного динатрий фосфата, 0,02 г фенолового красного, 0,001 г бриллиантового зеленого, 2,4 мл 50%-ного водного раствора мочевины (1,2 г) . Для приготовления верхнего слоя в 700 мл дистиллированной воды растворяют 0,35 г экстракта кормовых дрожжей, 9,52 г лактозы, 6,3 г агара, 4,9 обезво- , женного динатрийфосфата, 0,56 г соли Мора, 0,056 г фенолового красного, 0,42 алкилбензолсульфата натрия

Пример 3. Отличается от примера 1 и 2 тем, что для приготовления нижнего слоя среды в 300 мл дистиллированной воды вносят 0,25 г экстракта кормовых дрожжей, 3,5 пептона, 1,5 г глюкозы, 2,2 г тиосульфата натрия, 2,0 агара, 2,5 г обезвоженного динатрийфосфата, 0,03 фенолового красного, 0,0015 г. бриллианте- . вого зеленого, 2,8 мл 5б%-ного водного раствора мочевины (1,4 г)о

Для приготовления верхнего слоя среды вносят 0,5 г экстракта кормовых дрожжей, 10,0 лактозы, 7,0 агара, 5,5т обезвоженного динатрийфосфата, 0,06 соли Мора, 0,06 г фенолового красного, 0,7 г алкилбензолсуль- фата натрия.

Приготовление сухой среды.

Пример 4 о Для приготовления нижнего слоя среды в шаровую мельницу емкостью 5 кг загружают 0,48 г экстракта кормовых дрожжей, 0,958 г пептона, 0,383 г глюкозы, 0,652 г тиосульфата натрия, 0,674 г обезвоженного динатрийфосфата, 0,008 г фенолового красного, 0,0003 г бриллиантового зеленого, 0,479 г микробиологического агара.

Смесь перемешивают в течение 1 ч. Выход 3,120 кг.

Для приготовления верхнего слоя в шаровую мельницу емкостью 10 кг загружают 0,112 г экстракта кормовых дрожжей, 3,036 г лактозы, 1,562 обезвоженного динатрийфосфата, 0,178 г соли Мора, 0,018 г фенолового красного, 0,134 г алкилбензолсуль фат натрия, 2,009 г микробиологического агара. Смесь перемешивают в течние 1 ч. Выход 6,800 кг. Общий вес среды 10 кг«

При сравнении дифференцирующих свойств сред установлено, что на средах ДУКС и Олькеницкого отсутствует или имеется очень незначительное се- роводородообразование у культур: Salmonella typhi H № 901, Proteus vulgaris HX19 № 222, Citrobacter № 33/61.

На среде ДУСК при интенсивном образовании сероводорода культурами группы протея некоторых сальмонелл (S.typhimurium, S.paratyphi В № 506) наблюдается полное почернение верхнего и нижнего столбиков среды, что затрудняет учет ферментации глюкозы. Среда ДУКС не дифференцирует микроорганизмы Klebsiella pneumonia и Ente- robacter aerogenes no тесту утилизации мочевины.

Модифицированная среда обладает более выраженными дифференцирующими свойствами, не требует стерилизации, при приготовлении ее не используется пищевое сырье. В готовом виде среда может храниться длительное время.

Формула изобретения

Двуслойная питательная среда для родовой идентификации энтеробактерий содержащая в верхнем слое агар, лактозу, источник железа,, соль фосфорно

- е6310906

кислоты, феноловый красный, селективный агент и дистиллированную воду, - а в нижнем слое - агар, глюкозу, соль фосфорной кислоты, тиосульфат натрия, феноловый красный, 50%-ный водный раствор мочевины, селективный агент и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повы 0 шения дифференцирующих свойств среды, она в верхнем слое дополнительно содержит экстракт кормовых дрожжей, в качестве агара - микробиологический агар, в качестве источника желе15 за - соль Мор а, в качестве соли фосфорной кислоты - обезвоженный ди- натрийфосфат в качестве селективного агента - алкчлбензолсульфат натрия, а в нижнем слое она дополнительно

20 содержит экстракт кормовых дрожжей и пептон, в качестве агара - микробиологический агар, в качестве соли фосфорной кистюты - обезвоженный динатрийфосфат, в качестве селектив25 ного агента - бриллиантовый зеленый при следующем количественном соотно0

5

0

5

0

5

шении компонентов, г/л;

Верхний слой: Экстракт кормовых дрожжей Лактоза

Обезвоженный дина;1- рлйфосфат Соль Мора Феноловый красный Алкилб ен з олсульфат натрия

Микробиологический агар

Дистиллированная вода

Нижний слой: Экстракт кормовых дрожжей Пептон Глюкоза

Тиосульфат натрия Микробиологический агар

Обезвоженный динатрийфосфатФеноловый красный 50%-ный водный раствор мочевины Бриллиантовый зеленый

Дистиллированная вода

0,2-0,5 8-10

4,5-5,5

0,49-0,6

0,056-0,06

0,4-0,7 5,8-7 0.7 л

0,10-0,25 0,25-3,5

1,0-1,5

1,9-2,2

1,0-2,0

2,0-2,5 0,02-0,03

1,1-1,4 0,001-0,0015 .0,3л j

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается родовой идентификации энтеробактерий. Цель изобретения - повышение дифференцирующих свойств среды. Навеску вещества нижнего слоя, включающего, г: ЭКД 0,1-0,25, пептон 2,5-3,5, глюкоза 1,0-1,5, тиосульфат натрия 1,9-2,2, микробиологический агар 1-2, обезвоженный динатрийфосфат 2,0-2,5, феноловый красный 0,02-0,03, бриллиан товый зеленый 0,001-0,0015 вносят в 300 мл дистиллированной воды, ки- пятят 2-3 мик, охлаждают до и прибавляют 1,1-1,4 г 50%-ного водного раствора мочевины, выдерживают 2- 3 сут, разливают по 2 мл в виде стол- биксг Навеску вещества верхнего слоя, состоящую из 0,2-0,5 г ЭКД, 8-10 г лактозы,5,8-7 г микробиологического агараs 4s5-5,5 г обезвоженного динатрийфосфата 0,49-0,6 г солк Мора, 0,056-0,6 г фен ттового красного, 0,4-0,7 алкипбензрдсу-тьфата натрия, вносят в 700 мл дистиллированной воды, кипятят 2-3 мин, охлаждают до 50°С и разливают по 4,5 мл поверх застывшего нижнего слоя и скашивают, - оставляя столбик в 2 см. О фермента- ции лактозы судят по изменению цвета агара в скошенной части, о ферментации глюкозы - в нижнем столбике, в котором при газообразовании появляют- ся пузырьки, об образовании сероводорода - -по почернению верхнего столбика средьь При гидролизе мочевины скошенная часть среды приобретает ярко-малиновый цвет,, а при росте протея - вся среда окрашивается в ярко-малиновый цвет,, s s DO