СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ В УСЛОВИЯХ ДИНАМИЧЕСКОГО ДИСПЕРГИРОВАНИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к фармакологии, а именно к способам лабораторных исследований.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа в условиях образующейся суспензии.

Известен способ определения антиокислительной активности липидов [1], заключающийся в исследовании растворителя липидов (смеси хлороформа с ледяной уксусной кислотой), окисляющегося субстрата (спиртового раствора йодистого калия) и катализатора (спиртового раствора перекиси водорода), которые вместе с антиоксидантом или контрольным раствором обеспечивают йодметрическую реакцию, контролируемую двукратно для вычисления основного показателя.

Недостатками способа являются образование суспензии при исследовании некоторых препаратов и в связи с этим низкая чувствительность.

Для исключения указанных недостатков предложен способ определения антиокислительной активности препаратов, образующих во время контакта с реагентами суспензию.

Для проведения исследования готовят 5 препаратов и составов. Ледяную уксусную кислоту, ксилол и диэтиловый эфир смешивают между собой в соотношении 1:4:1 (раствор N 1), 96^o-ный этиловый спирт смешивают с йодистым калием (раствор N 2), образуя 0,7%-ный спиртовой раствор; 40%-ную перекись водорода смешивают с 96^o этиловым спиртом в соотношении 1:30 (раствор N 3); диэтиловый эфир (препарат N 5) используют вне составов.

Определение антиокислительной активности проводят на основе спектрофотометрических данных реакции при длине волны 420 нм.

В кювету спектрофотометра с термостатическим устройством, поддерживающим температуру 35^oC, наливают 1,0 мл раствора N 1, а затем последовательно 0,2 мл раствора N 3, 0,2 мл препарата N 5 и 0,3 мл препарата N 5. Полученную смесь встряхивают в течение 2 мин и смешивают с 0,5 мл 96^o этилового спирта, после чего фотоколориметрируют или спектрофотометрируют. Измеренная оптическая прозрачность в % представляет собой эквивалент прозрачности по йоду и оценивает степень дисперсности (I_экв.) неокрашенной жидкости. Затем к смеси приливают 0,2 мл раствора N 2, инкубируют при температуре 35^oC в течение 3 мин и спектрофотометрируют, регистрируя оптическую прозрачность в % цветной суспензии. Далее смесь инкубируют еще 10 мин и регистрируют оптическую прозрачность. Жидкость переносят в водяную баню для инкубации в течение 12-24 ч, после чего определяют окончательную оптическую прозрачность суспензии. Полученные показатели последовательно вводят в форму вычисления концентрации йода, которую получают путем аппроксимации данных калибровочной кривой:

где
X - оптическая прозрачность суспензии в %.

Определяют коэффициент резервной концентрации k

где
I_max - максимальная концентрация йода, полученная через 12-24 ч инкубации;
I₁₀ - концентрация йода, полученная через 10 мин инкубации;
I₃ - концентрация йода, полученная через 3 мин инкубации;
I_экв. - эквивалент концентрации йода по неокрашенной суспензии.

Вычисляют антиокислительную активность исследуемого препарата:

где
I₁₀ - концентрация йода, полученная через 10 мин инкубации;
I₃ - концентрация йода, полученная через 3 мин инкубации;
2,4 - общий объем реакционной смеси (мл);
12 - поправочный коэффициент;
n - кратность разведения;
0,3 - коэффициент компрессии разведения;
10 - продолжительность инкубации (мин);
0,2 - объем антиоксиданта (мл);
k - коэффициент резервной концентрации.

Составные части реакционной смеси действуют следующим образом.

Раствор N 1 представляет собой среду разведения и растворения до образования суспензии. Раствор N 2 является основным субстратом окисления и источником йода в реакции. Раствор N 3 представляет собой катализатор окисления в среде органических соединений. Диэтиловый эфир и этиловый спирт гомогенизируют суспензию и предотвращают быстрое оседание. Встряхивание дает наиболее мелкодисперсную суспензию.

Предложенную формулу расчета антиокислительной активности объясняются следующим образом.

В основе формулы лежит величина, изменяющаяся в течение определенного времени, значение которой растет с увеличением абсолютных концентраций йода, а также их разницы. Для стандартизации исходного уровня активности в формуле присутствует объем реакционной смеси. Учитывая эффект разведения, заключающийся в увеличении разницы абсолютных показателей концентраций йода и, следовательно, антиокислительной активности, в формулу введен коэффициент компрессии разведения, приводящий в соответствие показатели разной концентрационной активности. Поправочный коэффициент приводит в соответствие антиокислительную активность по данным АОА образцового препарата (оливкового масла). Коэффициент резервной концентрации обеспечивает расширение диапазона АОА при появлении суспензии во время исследования путем обратно пропорционального сдвига собственных значений к величине I_экв..

Способ иллюстрирует следующий пример четырехкратного измерения оптической прозрачности и полученный результат антиокислительной активности гепарина, представленные в таблице.

Способ может быть использован в лабораторных исследованиях. Исследование препарата проводят, четырехкратно спектрофотометрируя продукты йодметрической реакции в присутствии органической кислоты и катализатора, измеряют оптическую прозрачность неокрашенной суспензии и образовавшегося цветового компонента. Результаты измерений вносят в расчетную формулу антиокислительной активности исследуемого препарата. Повышается чувствительность при исследовании препаратов, образующих суспензию. 1 табл.

Способ определения антиокислительной активности препарата в условиях динамического диспергирования, включающий проведение йодметрической реакции с инкубацией в присутствии органической кислоты и катализатора с последующей спектрофотометрией, отличающийся тем, что перед проведением иодметрической реакции определяют эквивалент I_экв., концентрации йода по неокрашенной суспензии, а в процессе проведения йодметрической реакции измеряют концентрацию йода в окрашенной суспензии через 3 мин инкубации, 10 мин инкубации и 12 - 24 ч инкубации и, учитывая общий объем реакционной смеси, поправочный коэффициент, кратность разведения антиоксиданта (исследуемого препарата), коэффициент компрессии разведения исследуемого препарата, продолжительность инкубации и коэффициент резервной концентрации, вычисляют антиокислительную активность АОА по формуле

где I₃ - концентрация йода, полученная через 3 мин инкубации и рассчитанная по универсальной для всех концентраций формуле, мкмоль,

где X - оптическая прозрачность суспензии, %:
I₁₀ - концентрация йода, полученная через 10 мин инкубации;
2,4 - общий объем реакционной смеси, мл;
12 - поправочный коэффициент;
n - кратность разведения исследуемого препарата;
0,3 - коэффициент компрессии разведения исследуемого препарата;
10 - продолжительность инкубации, мин;
0,2 - объем исследуемого препарата, мл;
k - коэффициент резервной концентрации, рассчитанный по формуле

где I_max - максимальная концентрация йода, полученная через 12 - 24 ч инкубации;
I_экв - эквивалент концентрации йода.