СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЛАТЕКСНОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к области биомедицинских технологий, в частности к способу получения антительной тест-системы на основе полимерных микросфер - носителей биолигандов для выявления антигенов: Leptospira canicola, Yersinia enterocolitica серотип O3, Salmonella pulorum, вирус инфекционного бронхита кур (ИБК) штамм H120 для постановки реакции латексной агглютинации (РЛА).

Известен способ получения антительной тест-системы для постановки реакции латексной агглютинации, включающий использование частиц, содержащих на поверхности карбоксильные группы, активированные карбодиимидом, к поверхности которых иммобилизуют специфический IgG к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorhagiae с ультразвуковой обработкой 3±0,5 мин и инкубацией при температуре 4°C, отмывкой дистиллированной водой, центрифугированием и добавлением физиологического раствора до первоначального объема [Патент РФ 2177617, кл. G01N 33/567 от 2001.12.27].

Однако такой способ иммобилизации антиглобулиновыми сыворотками обеспечивает случайную ориентацию специфических IgG на поверхность полимерных микросфер.

При случайной иммобилизации IgG на поверхность полимерных микросфер активные центры IgG могут оказаться недоступными для взаимодействия с детерминантными участками антигена, что приведет к ухудшению чувствительности реакции латексной агглютинации (РЛА).

Если же молекула специфического IgG фиксирована на поверхности полимерного носителя Fc-фрагментом, а Fab-фрагмент, несущий активные центры, оказывается ориентирован "наружу", то вероятность взаимодействия с детектируемым участком антигена значительно увеличится, что скажется на улучшении чувствительности реакции латексной агглютинации.

Наиболее близким техническим решением по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ получения антительной тест-системы для постановки реакции латексной агглютинации, включающий иммобилизацию антиглобулиновых сывороток, содержащих специфические IgG, к различным заболеваниям на частицы полиакрилового латекса с последующим выдерживанием в течение 4 ч при комнатной температуре, pH 7,0-7,4 и 12 ч при 4°C при постоянном равномерном перемешивании [Патент РФ 2012888, кл. G01N 33/531 от 1994.05.15].

Однако такой способ имеет недостаточно высокую чувствительность реакции латексной агглютинации при выявлении антигенов.

Технический результат изобретения - получение антительной тест-системы с высокой чувствительностью реакции латексной агглютинации при выявлении антигенов различной природы: Leptospira canicola, Yersinia enterocolitica серотип O3, Salmonella pulorum, вирус инфекционного бронхита кур (ИБК) штамм H120.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в предложенном способе необходимо к поверхности полимерных микросфер иммобилизовать протеин А (штамма Staphylococcus aureus), выполняющий роль спейсера, а затем через него присоединить специфический IgG.

Для этого смешивают в равных объемах (по 1 мл) физиологический раствор, содержащий протеина А (штамма Staphylococcus aureus) в концентрации 0,05 мг/мл, и полимерные микросферы 0,5%-ной полимерной суспензии, помещают в термостат при +36-38°C на 4-6 час (процесс иммобилизации). После иммобилизации отмывают полимерную суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин. Осадок смешивают с 1 мл антиглобулиновой сыворотки, помещают в термостат при +36-38°C на 4-6 час (процесс иммобилизации). После иммобилизации отмывают полимерную суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин. Осадок смешивают с 1 мл физиологического раствора, содержащего альбумин 0,07-0,15%.

Температурные режимы +36-38°C установили исходя из оптимальной температуры для белков, при которых не происходит их денатурации.

Установлено, что в течение 4 часов при температуре 37°C с поверхностью полимерных микросфер связывалось 80% белка от исходного количества белка в растворе. Дальнейшая экспозиция не приводит к увеличению количества связанного белка, что обусловлено отсутствием свободной поверхности полимерных микросфер.

Полученная антительная тест-система для выявления антигена используется в постановке реакции латексной агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Примеры.

Пример 1.

Смешивают в равных объемах (по 1 мл) физиологический раствор, содержащий протеина А (штамма Staphylococcus aureus) в концентрации 0,05 мг/мл, и полимерные микросферы 0,5%-ной полимерной суспензии, помещают в термостат при +36-38°C на 4-6 час (процесс иммобилизации). После иммобилизации отмывают полимерную суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин. Осадок смешивают с 1 мл антиглобулиновой сыворотки, содержащей специфические IgG к L. Canicola, помещают в термостат при +36-38°C на 4-6 час (процесс иммобилизации). После иммобилизации отмывают полимерную суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин. Осадок смешивают с 1 мл физиологического раствора, содержащего альбумин 0,07-0,15%.

Полученную антительную тест-систему для выявления антигена L. Canicola используют в постановке реакции латексной агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Выявляемая минимальная концентрация антигена L. canicola, полученная антительной тест-системой в РЛА, составила 4296 кл/мл.

Пример 2.

Антительную тест-систему для выявления антигена Y. Enterocolitica готовили, как в примере 1, но в качестве иммобилизации антиглобулиновой сыворотки, содержащей IgG к L. Canicola на поверхность полимерных микросфер, иммобилизовали антиглобулиновую сыворотку, содержащую специфические IgG к Y. Enterocolitica.

Антительную тест-систему для выявления антигена Y. Enterocolitica используют в постановке реакции латексной агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Выявляемая минимальная концентрация антигена Y. Enterocolitica, полученная антительной тест-системой в РЛА, составила 0,061 мкг/мл.

Пример 3.

Антительную тест-систему для выявления антигена S. pulorum готовили, как в примере 1, но в качестве иммобилизации антиглобулиновой сыворотки, содержащей IgG к L. Canicola на поверхность полимерных микросфер, иммобилизовали антиглобулиновую сыворотку, содержащую IgG к S. Pulorum.

Антительную тест-систему для выявления антигена S. pulorum используют в постановке реакции латексной агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Выявляемые минимальные концентрации антигена S. pulorum, полученные антительной тест-системой в РЛА, составили: для S. Pulorum фракция О-антигена с молекулярной массой антигена 300 кД - 1,09 мкг/мл; для S. Pulorum фракция О-антигена с молекулярной массой антигена 100-300 кД - 1,95 мкг/мл; для S. Pulorum фракция О-антигена с молекулярной массой антигена 30-100 кД - 0,02 мкг/мл.

Пример 4.

Антительную тест-систему для выявления антигена вируса инфекционного бронхита кур (ИБК) штамм H120 готовили, как в примере 1, но в качестве иммобилизации антиглобулиновой сыворотки, содержащей IgG к L. Canicola на поверхность полимерных микросфер, иммобилизовали антиглобулиновую сыворотку, содержащую IgG к вирусу ИБК штамм H120.

Антительную тест-систему для выявления антигена вируса ИБК штамм H120 используют в постановке реакции латексной агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Выявляемая минимальная концентрация антигена вируса ИБК штамм H120, полученная антительной тест-системой в РЛА, составила 10⁵ ЭИД/₅₀ (эмбриональная инфекционная доза).

Предлагаемый способ получения антительной тест-системы увеличит чувствительность реакции латексной агглютинации (РЛА) при выявлении антигенов различной природы: Leptospira canicola, Yersinia enterocolitica серотип O3, Salmonella pulorum, вирус инфекционного бронхита кур (ИБК).

Антительные тест-системы найдут применение в медицине и ветеринарии при выявлении антигенов потенциальных возбудителей заболеваний, что позволит принять соответствующие меры лечения и профилактики.

Изобретение относится к области биомедицинских технологий, в частности к способу получения антительной тест-системы на основе полимерных микросфер - носителей биолигандов (протеин А, специфический иммуноглобулин G) для выявления антигенов: Yersinia enterocolitica серотип O3, Leptospira canicola, Salmonella pulorum, вируса инфекционного бронхита кур (ИБК) штамм H1 20. Способ получения антительной тест-системы заключается в том, что смешивают в равных объемах физиологический раствор, содержащий протеина А (штамма Staphylococcus aureus), и полимерные микросферы 0,5%-ной полимерной суспензии. Смесь помещают в термостат при +36-38°С, отмывают полимерную суспензию, осадок смешивают с физиологическим раствором, содержащим специфические IgG к одному из антигенов. Полученную смесь выдерживают в термостате при +36-38°С, отмывают полимерную суспензию, осадок смешивают физиологическим раствором, содержащим альбумин. Использование способа позволяет получить тест-системы с высокой чувствительностью реакции латексной агглютинации при выявлении антигенов Yersinia enterocolitica, Leptospira canicola, Salmonella pulorum, вируса ИБК.

Способ получения антительной тест-системы для постановки реакции латексной агглютинации, отличающийся тем, что проводят иммобилизацию протеина А штамма Staphylococcus aureus в концентрации 0,05 мг/мл на поверхность окрашенных полимерных микросфер с диаметром частиц 1,2 мкм, представляющих собой сополимер стирола, акролеина, стиролсульфоната натрия, в физиологическом растворе при температуре 36-38°С в течение 4-6 ч, причем концентрация полимерных частиц в полимерной суспензии составляет 0,5% по сухому остатку полимера, далее отмывают полимерную суспензию на центрифуге три раза по 15 мин при 4000 об./мин, осадок смешивают с антиглобулиновой сывороткой, которая содержит специфические иммуноглобулины, выдерживают при 36-38°С 4-6 ч, отмывают полимерную суспензию на центрифуге три раза по 15 мин при 4000 об./мин, осадок смешивают с 0,07-0,15%-ным физиологическим раствором альбумина.